Institutionen för Biologi och bioteknik  

CHALMERS TEKNISKA HÖGSKOLA 

Göteborg, Sverige 2017 

	

 

 

 

 

 

Värmestabila enzym från svampen Scytalidium 
thermophilum 
Kandidatarbete inom bioteknik 

  
Författare:                                                                             Handledare: 

BERGKLINT Sofia                                                               LARSBRINK Johan 
BERGMAN Sebastian                                                           HÜTTNER Silvia 
LARSSON Elise                                                                    ARNLING BÅÅTH Jenny 
NYDAHL Karin 
PERSSON Frida                                                                    Examinator: 
ÅSTRÖM Marianne                                                              ALBERS Eva 
 

  



	 	 	
	

	 	 	
	

Förord  
Vi som har skrivit denna rapport är sex tredjeårsstudenter på civilingenjörsprogrammet i 
bioteknik, Institutionen för Biologi och bioteknik, Chalmers tekniska högskola. Projektet är 
vårt kandidatarbete och genomfördes under vårterminen 2017, omfattningen är 15 hp per 
student. 

Arbetet bygger på ett tidigare kandidatarbete, Karaktärisering av tropiska svampar och deras 
enzymer, BBTX01-16-06, som genomfördes våren 2016 av John Andersson, Josefin Blell, 
Edvin Blomstrand, Olle Hartvigsson, Hanna Törnkvist och Alvina Westling. 

Vi vill framföra ett stort tack till vår handledare Johan Larsbrink som under hela projektet har 
guidat och stöttat oss i projektets utformning. Vi vill särskilt tacka för all din noggranna och 
konstruktiva kritik vid rapportskrivandet, det var guld värt.  

Stort tack även till handledarna Jenny Arnling Bååth och Silvia Hüttner för all hjälp och 
stöttning med det laborativa arbetet, det hade inte gått utan er. Vi har uppskattat att vi kunnat 
fråga er om allt ifrån upplägg till små detaljer, när som helst, utan att vi känt oss i vägen eller 
att vi stört er.  

Tack till alla på labbet för industriell bioteknik och tack till Göteborgs Universitet för att vi 
fick använda er laborationssal. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	 	 	
	

	 	 	
	

Sammanfattning 
De miljöproblem som världen idag står inför beror till stor del på förbränning av fossila 
råvaror. En av de största utmaningarna för att minska den negativa miljöpåverkan är att hitta 
sätt att använda förnybart kol, till exempel i form av växtbiomassa, istället för fossilt. I detta 
kandidatarbete, som genomförts på Chalmers tekniska högskola år 2017, har den sedan 
tidigare okända stammen FCH 6.2 av den termofila filamentösa svampen Scytalidium 
thermophilum undersökts som källa till enzym för omvandling av växtbiomassa. Målet med 
projektet var att hitta så effektiva och värmestabila enzym som möjligt. Därför har svampen 
odlats på flera olika odlingssubstrat (kolkällor), samt enligt två olika odlingsmetoder, flytande 
kultur och en kultur där endast en liten mängd vätska tillsätts till kolkällan. Målet var sedan 
att jämföra resultaten mellan olika odlingar för att se vilken kolkälla och odlingsmetod som 
genererat mest enzym med så hög enzymatisk aktivitet som möjligt. För att kunna jämföra de 
olika odlingarna mättes proteinkoncentrationen i extraktionslösningarna. Därefter jämfördes 
enzymens aktivitet på både naturliga polysackarider och syntetiska enzymsubstrat. Resultatet 
visade att S. thermophilum producerade värmetåliga enzym som hade aktivitet vid både 60° C 
och 70° C. Därav kan enzym producerade av S. thermophilum FCH 6.2 vara av intresse för 
användning inom industrier. Mer forskning skulle kunna visa vilka enzym som produceras vid 
odling på olika kolkällor. Vidare vore det intressant att jämföra enzymen med kommersiella 
enzymblandningar för att få en uppfattning om enzymens effektivitet.  

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 



	 	 	
	

	 	 	
	

Abstract  
The environmental problems that the world faces today depends largely on combustion of 
fossil fuels. One of the greatest challenges is therefore to find novel ways to discover 
renewable carbon-based energy sources to reduce the negative environmental impact. This 
could be done by using different forms of plant biomass, instead of fossil. In this bachelor 
project, conducted at Chalmers University of Technology during 2017, a specific fungus was 
examined as a source for enzymes for conversion of plant biomass. More specifically, the 
previously unknown strain named FCH 6.2 of the thermophilic filamentous fungus 
Scytalidium thermophilum. The goal with the project was to find as effective and thermostable 
enzymes as possible. Therefore, the fungus was grown on several different types of growth 
substrates and carbon sources. Furthermore, it was grown according to two different types of 
cultivation techniques, liquid culture and solid state fermentation. The purpose was to 
compare the results between the different cultures, to see what type of carbon source and 
cultivation technique that generated the largest amount of enzyme, with the highest possible 
enzymatic activity. The protein concentrations were measured in the extraction solutions to 
compare the different cultures. Thereafter the enzymatic activity was compared on both 
natural polysaccharides and synthetic enzyme substrates. The result showed that S. 
thermophilum produced heat-resistant enzymes with activity at both 60 ° C and 70 ° C. 
Hence, enzyme produced by S. thermophilum FCH 6.2 may be of interest for use in industries. 
More research could show which enzymes are produced when the fungus is grown on 
different carbon sources. Furthermore would it be interesting to compare the enzymes with 
established enzyme cocktails to get an idea of the enzymes efficiency. 
  

 

 

 

 

 

 

 

 
 

  



	 	 	
	

	 	 	
	

Innehållsförteckning 
1. Inledning .............................................................................................................................................. 1 

1.1 Syfte och problemformulering .................................................................................................... 2 

1.2 Avgränsningar .............................................................................................................................. 2 

2. Teori ..................................................................................................................................................... 4 

2.1 Kolkällor som användes för odling av S. thermophilum ........................................................... 4 

2.1.1 Cellulosa ................................................................................................................................. 6 

2.1.2 Hemicellulosor ....................................................................................................................... 6 

2.1.3 Vetekli ..................................................................................................................................... 8 

2.1.4 Trä - uppbyggnad av växtcellväggen ................................................................................... 8 

2.2 Enzym ............................................................................................................................................ 9 

3. Metod ................................................................................................................................................. 11 

3.1 Sportillväxt .................................................................................................................................. 11 

3.2 Odling av S. thermophilum på olika kolkällor ......................................................................... 12 

3.2.1 Flytande odling .................................................................................................................... 12 

3.2.2 SSF-odling ............................................................................................................................ 12 

3.3 Enzymextraktion ur biomassa ................................................................................................... 13 

3.4 Enzymanalys ............................................................................................................................... 13 

3.4.1 Mätning av proteinkoncentration ...................................................................................... 13 

3.4.2 Koncentrationsmätningar på reducerande sockerändar ................................................. 13 

3.4.3 Aktivitetsmätningar på syntetiska substrat ...................................................................... 15 

4. Resultat och analys ........................................................................................................................... 17 

4.1 Odlingar ....................................................................................................................................... 17 

4.2 Bradfordanalys ........................................................................................................................... 18 

4.3 Aktivitetsmätningar över natt ................................................................................................... 19 

4.4 Koncentrationsmätningar vid tidsuppföljning ........................................................................ 21 

4.5 Koncentrationsmätningar vid temperaturökning ................................................................... 23 

5. Diskussion .......................................................................................................................................... 27 

6. Slutsats ............................................................................................................................................... 29 

Källförteckning ..................................................................................................................................... 30 

Bilaga 1 .................................................................................................................................................. 33 

Bilaga 2 .................................................................................................................................................. 35 

	

 



	 	 	
	

1	
		

1. Inledning 
En av vår tids största utmaningar är att hitta lösningar på de klimathot som världen står inför. En 
betydande orsak till den globala uppvärmning som sker idag är förbränning av fossila råvaror. 
Idag används fossila bränslen inom många olika områden, och förbränning av dessa bränslen 
leder till koldioxidutsläpp som i sin tur i hög grad bidrar till den globala uppvärmningen. Vidare 
är tillgången på fossila bränslen begränsad och det är därför inte ett hållbart alternativ varken ur 
miljösynpunkt eller ur tillgångssynpunkt. Ett sätt att minska den globala uppvärmningen kan 
vara att byta ut fossilt kol mot förnybart kol i industriella processer (Newman, 2008). 
Växtbiomassa är den största källan till förnybart kol på planeten och skulle kunna användas 
istället för fossilt kol (Kaur et al., 2015). Växtbiomassa är biologiskt material som består 
mestadels av polymerer såsom polysackarider och lignin (Tao, 2014). Idag används 
växtbiomassa i många processer inom till exempel skogs- och massaindustrin. Att kunna 
tillvarata energin som är lagrad i växtbiomassan är önskvärt både vid industriella processer och 
vid biobränsletillverkning via fermentering av enkla sockerarter. Ett problem med dagens 
processer är att det i dessa bildas restprodukter av växtbiomassa som är svåra att omvandla till 
något användbart. Exempel på sådana produkter är lignin och hemicellulosa som bildas som 
restprodukter i massa- och pappersindustrin (Pińkowska, Wolak, & Złocińska, 2011). Med rätt 
omvandlingsmetod skulle dessa produkter exempelvis kunna användas som drivmedel (Van Den 
Brink & De Vries, 2011). En fördel med att ta tillvara på spill- eller outnyttjade produkter är att 
det inte konkurrerar med nuvarande matproduktion (Cox, 2014).  

I naturen bryts växtbiomassa till stor del ner av mikroorganismer som använder sig av enzym för 
nedbrytningen. Många av dessa nedbrytande mikroorganismer är svampar (Demirbas, 2014). 
Svampar är heterotrofa, vilket innebär att de får sin energi genom att bryta ner organiskt 
material såsom växtbiomassa. För att överleva behöver svampen tillgodose sitt behov av flera 
näringsämnen, bland annat kol, kväve och fosfor. Polysackariderna i växtbiomassan tillgodoser 
svampen med kol och energi, och kommer i detta arbete att kallas för kolkällor. För att kunna 
bryta ner växtbiomassan utsöndrar svamparna extracellulära enzym från hyferna (Taylor, Raper, 
& Williams, 2014). Den nedbrutna växtbiomassan kan sedan tas upp av svampen och användas 
som näring. Växtbiomassan utgörs av komplexa substrat, som innehåller många olika typer av 
bindningar, och bryts ner bland annat genom att polysackarider bryts ner till monosackarider 
och korta oligosackarider (Mäkelä & de Vries, 2014). Det finns grupper av enzym som klipper 
från kedjornas ändar (exo-aktivitet) och enzym som klipper mitt i en kedja (endo-aktivitet) 
(Percival Zhang, Himmel, & Mielenz, 2006). 

Det är möjligt att utvinna svampars enzym för nedbrytning av växtbiomassa även för 
industritekniska tillämpningar. Enzym används industriellt inom många olika områden, till 
exempel vid tillverkning av textil, rengöringsmedel och djurfoder (Mäkelä & de Vries, 2014). 
Inom industrin finns det idag en stor efterfrågan av enzym som kan bidra till kostnadseffektiva 
processer (Li, Yang, Yang, Zhu, & Wang, 2012). För att upptäcka nya enzym kan ostuderade 
svampar studeras. Det finns omkring 1,5 miljoner svamparter och av dem är enbart fem procent 
beskrivna i litteraturen. Den största biologiska mångfalden förväntas finnas i tropiska miljöer 
(Berrin et al., 2012). Denna mångfald bidrar till stor diversitet olika arter emellan och därmed 
också mellan deras enzym. Dessutom påverkar odlingsbetingelser vilka gener som uttrycks hos 
svampen (Boonlue, Aimi, & Morinaga, 2003), vilket leder till att olika enzym produceras då 
svampen växer på olika kolkällor. Till en början försöker alltid svampen att ta till sig enkla 



	 	 	
	

2	
		

substrat som exempelvis glukos eftersom det är mindre energikrävande. Därför uttrycks gener 
för produktion av enzym som bryter ned mer komplexa substrat först då den filamentösa 
svampen inte har tillgång på annat (Amore, Giacobbe, & Faraco, 2013). För att få fram effektiva 
enzymblandningar kan olika svampars enzym kombineras (Mäkelä & de Vries, 2014).  

Vid sökandet av nya effektiva enzym är termofila svampar särskilt intressanta. Termofila arter 
trivs i värme och kan leva vid temperaturer över 40 °C. Många termofila arter har ett 
temperaturoptimum vid 45- 50 °C (Wiegant, 1992). Enzym från termofila organismer är 
verksamma vid högre temperaturer och är då särskilt intressanta för industriella processer. Vid 
högre temperaturer går kemiska processer snabbare och enzym från värmetåliga svampar skulle 
kunna ge effektivare processer med minskad risk för mikrobiell kontaminering, då färre 
mikroorganismer kan växa vid höga temperaturer (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & 
Stahl, 2015). För att öka användningen av enzym fokuserar numera en stor del av 
enzymforskningen på termofiler för att hitta termostabila enzym med potentiell stor användning 
inom industrin (Basotra, Kaur, Di Falco, Tsang, & Chadha, 2016).  

1.1 Syfte och problemformulering  
En termofil och filamentös svamp som har visat god tillväxt vid 50 °C och förmåga att bryta ned 
olika typer av växtbiomassa är Scytalidium thermophilum (Wiegant, 1992). I ett kandidatarbete, 
som genomfördes år 2016 på Chalmers tekniska högskola, studerades bland annat stammen 
FCH 6.2 av S. thermophilum (Blomstrand, Hartvigsson, Törnkvist, & Westling, 2016). Stammen 
FCH 6.2 är sedan tidigare ostuderad och isolerades från kompost i Vietnam där den växte på 
flera olika näringskällor. Blomstrand et al. (2016) visade att FCH 6.2 växte bland annat på 
cellulosa, xylan, xylos och mer komplexa kolkällor som vetekli. Svampstammen valdes ut bland 
sex andra svampstammar av samma art till detta kandidatarbete, eftersom den växte snabbt och 
hade tillväxt på många kolkällor. Det är okänt hur mycket FCH 6.2-stammen skiljer sig från 
andra studerade stammar av S. thermophilum.  

Målet med detta kandidatarbete är att undersöka värmestabiliteten hos enzym som producerats 
av svampen S. thermophilum. Då svampen odlas på olika kolkällor erhålls olika kombination av 
enzym, det vill säga olika fenotyper. Därför har inverkan på enzymens stabilitet undersökts, med 
avseende på olika odlingssubstrat i form av olika kolkällor. För att få en uppfattning om 
enzymens egenskaper och effektivitet genomfördes aktivitetsmätningar med två olika 
mätmetoder. För båda metoderna användes spektrofotometri för att mäta färgomslag. 
Färgomslaget indikerade i hur stor utsträckning en reaktion skett och kan relateras till aktiviteten 
hos enzymen. Eftersom egenskaperna hos stammen FCH 6.2 till stor del är okända är det 
intressant att jämföra två olika odlingssätt för att se vilken typ av odling som är bäst för denna 
stam vid enzymproduktion.   

1.2 Avgränsningar 
Projektet var från början avgränsat till att endast behandla stammen FCH 6.2 av  
S. thermophilum. Projektet avgränsades så att svampen endast odlades vid 50 °C. Vid 
temperaturanalyser av enzymen valdes temperaturerna 50, 60 och 70°C. Med hänsyn till 
projektets tidsbegränsning var det inte genomförbart att testa en större mängd olika kolkällor.   



	 	 	
	

3	
		

 

Figur 1. Avgränsningar under projektets gång. 

I projektets översiktsförsök odlades svampen enligt två olika odlingsmetoder på de kolkällor 
som valdes ut vid projektets början: galaktomannan, cellulosa, xylan, vetekli, barkpulver från 
gran och träpulver från gran. Enzymlösningar från odlingarna analyserades först genom mätning 
av den totala proteinkoncentrationen och analyserades därefter med två olika 
aktivitetsmätningar. Den odlingstyp, de kolkällor samt de enzymsubstrat som gav bäst aktivitet 
valdes ut för fortsatta studier. Figur 1 visar avgränsningar som skedde under projektets gång.  

  



	 	 	
	

4	
		

2. Teori 
I kapitel två presenteras ett teoretiskt ramverk som är nödvändigt för att förstå kandidatarbetet. 
Först redovisas de kolkällor som svampen S. thermophilum har odlats på, därefter följer ett 
avsnitt om enzym. Det bör noteras att vissa kolkällor som används som odlingssubstrat även 
tillämpades som enzymsubstrat för aktivitetsmätning. Begreppet kolkälla definieras i rapporten 
som det odlingssubstrat som svampen fick växa på för att få tillgång till kol och energi.  

2.1 Kolkällor som användes för odling av S. thermophilum 
Polysackarider är kolhydrater som består av långa kedjor av sammanlänkade monosackarider. 
Om polysackariden är uppbyggd av enbart en typ av monosackarid, till exempel stärkelse eller 
cellulosa som består av D-glukos, klassificeras den som en homopolysackarid. Om den däremot 
är uppbyggd av olika slags monosackarider klassificeras den istället som en heteropolysackarid. 
Skillnaden mellan polysackarider och oligosackarider är svårdefinierad, men en tumregel säger 
att en oligosackarid består av en kortare kedja på mindre än tio sammanlänkade monosackarider 
(Hassid, 2014).  
 
En monosackarid klassificeras efter dess karbonylgrupp samt antalet kolatomer i molekylen. Om 
en kolatom kan binda till fyra olika grupper kallas den för kiral. En monosackarid som 
innehåller en kiral kolatom har stereoisomerer, vilket innebär att de två molekylerna är 
spegelbilder av varandra men har samma kemiska och fysikaliska egenskaper. De skiljer sig åt 
gällande i vilken riktning de roterar planpolariserat ljus. Isomeren benämns som D om ljuset 
roteras åt höger och L om ljuset roteras åt vänster (McGrane, 2014). En vanlig monosackarid är 
glukos, vars isomerer illustreras i Figur 2.  

 



	 	 	
	

5	
		

 

Figur 2. Stereoisomerer (D och L) av glyceraldehyd och glukos. Då planpolariserat ljus roteras åt höger benämns 
isomeren som D och om ljuset roteras åt vänster benämns molekylen istället som L (McGrane, 2014). Figuren 
används med tillstånd från McGraw-Hill Education. 

 
Monosackarider bildar ofta intramolekylära ringstrukturer. Då existerar istället diastereomererna 
α och β, och strukturen skiftar i lösning mellan dem. Dessa har till skillnad från L- och D-
isomerer olika kemiska och fysikaliska egenskaper. Om OH-gruppen pekar ut axiellt från ringen 
benämns molekylen som β och om gruppen pekar ut ekvatoriellt klassificeras monosackariden 
som en α-isomer (McGrane, 2014), vilket illustreras i Figur 3. Då monosackarider binder 
samman till oligo- eller polysackarider kan de däremot inte skifta mellan α och β strukturer.  

 

Figur 3. Jämvikt för glukosstruktur. Då hydroxidgruppen i en ringformad glukosmolekyl pekar ut ekvatoriellt 
benämns molekylen som en α-isomer, då den pekar ut axiellt klassificeras molekylen istället som en β-isomer 
(Calvaro, 2006). CC BY-SA.  



	 	 	
	

6	
		

2.1.1 Cellulosa 
Cellulosa är den mest förekommande och starkaste beståndsdelen i trä, och är lokaliserad i 
cellväggen. Polymeren är en homopolysackarid som består av β- D-glukopyranosenheter som 
binds ihop via glykosidbindningar (Sjöström, 1993), se Figur 4.  

 

 

Figur 4. Illustration av den kemiska uppbyggnaden av cellulosa, som är uppbyggd av β-D-glukopyranosenheter 
länkade via glykosidbindningar (Laghi.I, 2013). CC BY-SA.  

Cellulosakedjor är helt linjära och tenderar att bilda intermolekylära vätebindningar. De bildar 
en kristallin struktur och är helt olösliga. Kedjorna har en icke-reducerande ände och en 
reducerande ände (aldehyd) (Sjöström, 1993). Även om polymeren består av linjära 
glukankedjor är den svårnedbruten (Peciulyte, Anasontzis, Karlström, Larsson, & Olsson, 
2014).  

2.1.2 Hemicellulosor 
Hemicellulosor är till skillnad från cellulosa generellt heterogena polysackarider. Mängden 
hemicellulosor i trä är omkring 20–30 % av torrvikten och polysackariderna är viktiga 
beståndsdelar i cellväggen. Hemicellulosor är uppbyggda av hexoser som D-glukos, D-mannos 
samt D -galaktos och pentoser, som D-xylos och L-arabinos. Uppbyggnaden skiljer sig mellan 
hemicellulosor i barrved och i lövved. Galaktomannan, arabinoglukuronoxylan och 
arabinogalaktan är de mest förekommande hemicellulosorna i barrved, medan xylan och 
glukomannan är de mest förekommande i lövved. Polysackariderna är mindre stabila än 
cellulosa (Henriksson & Lennholm, 2009).  

Xylan är den mest förekommande hemicellulosan som främst består av en huvudkedja av 
sammanlänkade xylosenheter. Strukturen och uppbyggnaden skiljer sig mellan olika växter, för 
exempel på strukturer se Figur 5. I barrved är xylaner surare eftersom de innehåller fler 4-O-
metyl-D-glukuronosylenheter. Xylaner i barrved innehåller även L-arabinossidogrupper, medan 
xylaner i lövved är acetylerade (Henriksson & Lennholm, 2009). I gräsarter som exempelvis 
vetekli innehåller xylan även sidogrupper av fenolsyror (Ebringerová & Heinze, 1999).  



	 	 	
	

7	
		

 

             
Figur 5. A. Illustration av den kemiska strukturen för xylan i lövved. B. Den kemiska strukturen för xylan i 
barrved. Som illustreras innehåller xylan i barrved fler karboxylsyror och är därmed surare än xylaner i lövved. C. 
Illustration av xylan i gräsarter. Den aromatiska gruppen är en ferulsyra (Yikrazuul, 2009). CC BY-SA.  

En annan typ av hemicellulosa är galaktomannan, som är en vanligt förekommande 
hemicellulosa i barrved. Uppbyggnaden består av en huvudsakligen linjär molekylkedja med 
små förgreningar, se Figur 6. Huvudkedjan består av (1-4)β-D-mannopyranos med sidogrupper 
av (1-6)α-D-galaktospyranos (Henriksson & Lennholm, 2009).  
 
 

 
Figur 6. Den kemiska strukturen för galaktomannan som är uppbyggd av en huvudkedja mannosenheter och 
sidogrupper av galaktos. Figuren används med tillstånd från Johan Larsbrink.  
 
 



	 	 	
	

8	
		

2.1.3 Vetekli 
Vetekli är en komplex kolkälla som tas fram från det yttre lagret på vetekornet. Detta lager 
består av fyra tunna skikt som tillsammans består till 53 % av kostfiber. Resterande innehåll är 
vitaminer, mineraler och bioaktiva föreningar såsom fenolsyror (Onipe, Jideani, & Beswa, 
2015). Kostfiber är de kolhydrater som människans enzym inte kan bryta ned, utan 
nedbrytningen sker av mikroorganismer i främst tjocktarmen (McGraw-Hill Education, 2003). 
Materialet är uppbyggt av cellulosa, hemicellulosor och pentosanpolymerer bestående av xylos 
och arabinos bundna till proteiner. Det finns lösliga och olösliga kostfiber. De lösliga som står 
för cirka 5 %, består främst av glukan och xylan (Onipe et al., 2015).  

 
2.1.4 Trä - uppbyggnad av växtcellväggen 
Cellväggen hos växter består främst av polysackarider, men även lignin, lipider och proteiner. 
Cellväggen beskrivs ofta utifrån dess primära och sekundära struktur. Alla växtceller omges av 
en primär cellvägg som ger dess slutgiltiga form och storlek. Den sekundära cellväggen skapas 
sedan då ved bildas, dess funktion är att ge mekanisk styrka (Sørensen & Rose, 2014).  
 
Den primära cellväggen är uppbyggd av ungefär lika mängder cellulosa, hemicellulosor och 
pektin, se Figur 7. Hemicellulosor binder in till cellulosa, och deras funktion i cellväggen är att 
ge stadga (Sørensen & Rose, 2014). Pektin är en klass av heterogena polysackarider som har en 
adhesiv funktion i cellväggen (Whistler & Daniel, 2014). 
 
 

Figur 7. Illustration över den primära cellväggen hos växter. Cellulosa och hemicellulosa binder till varandra och 
befinner sig i den primära cellväggen där de ger stadga. Pektiner återfinns i den primära cellväggen samt i mellersta 
lamellen där de har en adhesiv funktion (Villarreal, 2015). CC BY-SA. 

 

Den sekundära cellväggen är placerad mellan plasmamembranet och den primära cellväggen, 
och är tjockare än den primära cellväggen. Den består främst av mycket kristallin cellulosa och 
dess funktion är att ge mekanisk styrka och skydd. Som illustreras i Figur 8 består den 



	 	 	
	

9	
		

sekundära cellväggen av flera olika lager. Cellulosafibrernas riktning varierar mellan lagren 
(Sørensen & Rose, 2014), vilket även illustreras i Figur 8.  

 

 
 

Figur 8. Figuren ger en modell av en sekundär cellvägg med olika lager. Beståndsdelen är främst kristallin 
cellulosa som har olika riktningar mellan lagren. Den sekundära cellväggen är mycket tjockare än den primära 
(Sørensen & Rose, 2014). Figuren används med tillstånd från McGraw-Hill Education. 
 
 

2.2 Enzym 
Enzym är mycket specifika katalysatorer, med en mängd olika funktioner i biologiska system. 
Vid kolhydratnedbrytning kan enzym ha förmåga att skilja på de sockerarter de binder till. De 
kan vara så specifika att de skiljer på vilken bindning mellan två monosackarider som de bryter 
ner (Wellner, 2016). Enzym kan erhållas genom att odla organismer på olika kolkällor. Eftersom 
olika kolhydrater har olika strukturer och bindningar behöver organismer producera olika typer 
av enzym för att kunna tillväxa på olika kolkällor (Peciulyte et al., 2014). 

För att bryta ner kolkällor från växtmaterial krävs en blandning av olika enzym med olika 
funktioner. Cellulosa kräver ett flertal enzym för nedbrytning trots att det endast innehåller en 
monosackarid, glukos, med en enda sorts bindning, β(1→4) (Himmel et al., 2007). En orsak till 
att cellulosa är svårt att bryta ner är att den kompakta strukturen gör det mycket svårt för vatten 
och därmed enzym i vattenlösning att komma åt molekylen. Nedbrytning av cellulosa sker 
främst av enzymgrupperna endoglukanaser, cellobiohydrolaser, CBH, och lytiska 
polysackaridmonooxygenaser, LPMO. Då LPMO kan klippa mitt i strukturen, genom oxidation 
i kristallina regioner, bildas amorfa regioner som är mer tillgängligt för vatten och andra enzym, 
till exempel endoglukanaser, som tillsammans spjälkar kolhydratkedjorna till kortare 
oligosackarider, se Figur 9 (Himmel et al., 2007). Det öppnar upp fler ändar som exoaktiva 
enzym kan angripa, CBH är exoglukanaser som klyver av disackarider från ändarna av 
cellulosakedjorna. Disackariderna kallas cellobios, de i sin tur sönderdelas av β-glukosidaser till 
glukos, vilket minskar produktinhibering för de andra enzymen (Faraco, 2013).  



	 	 	
	

10	
	

 

Figur 9. Nedbrytning av cellulosa med hjälp av olika enzym, figuren används med tillstånd från Johan Larsbrink.  

Då hemicellulosa är en heterogen grupp av polysackarider krävs fler olika enzym för 
nedbrytning, dels enzym som bryter bindningar i huvudkedjorna, dels enzym som klipper av de 
grenade sidokedjorna. Två huvudgrupper av enzym är glykosidhydrolaser, GH och 
kolhydratesteraser, CE (Faraco, 2013).  
 

  



	 	 	
	

11	
	

3. Metod 
I kapitel tre presenteras de odlingsmetoder samt metoder för enzymanalys som har använts. 
Figur 10 visar ett förenklat flödesschema där det går att följa alla steg från de första odlingarna 
till enzymanalys.  

 

Figur 10. Översiktligt flödesschema för alla steg från odling på PDA-plattor (potatisdextrosagar) till enzymanalys.  

Apparater, utrustning och kemikalier som användes fanns på avdelningen för industriell 
bioteknik. De kemikalierna som köptes in specifikt för projektet var vissa syntetiska 
enzymsubstrat från Carbosynth. För att undvika kontamination, både till och från 
svampkulturen, utfördes allt arbete med kulturerna med sterilteknik i laminärflödesbänk, avsedd 
för arbete med svamp. När enzymen extraherats krävdes inte sterilt arbete, utan 
enzymanalyserna utfördes i dragskåp som skydd mot de kemikalier som användes. Allt vatten 
som användes i laborationerna var ultrarenat genom filtrering med vattenrenare från Millipore, 
så kallat MilliQ®-vatten. Absorbansmätningarna utfördes i en spektrofotometer för 
mikrotiterplattor, FLUOstar® Omega, BMG Labtech, med linjärt område mellan 0 och 4 för 
absorbans. 

3.1 Sportillväxt 
För att erhålla tillräcklig mängd svampsporer som krävs för att inokulera odlingar med  
S. thermophilum, odlades svampen i petriskålar på potatisdextrosagar, PDA. PDA är ett 
komplext medium som ger god tillväxt för en mängd mikroorganismer. PDA-lösning bereddes 
genom att PDA-pulver (Sigma-Aldrich) löstes upp i angiven mängd MilliQ®-vatten så att en 
koncentration på agar 15 g/l, dexros 20 g/l och potatisextrakt 4 g/l erhölls. Den färdigblandade 
PDA-lösningen autoklaverades innan den, fortfarande varm, hälldes upp i tomma, sterila 
petriskålar och tilläts stelna.  

Till varje PDA-platta tillsattes 1 ml sporlösning från tidigare odling, plattorna inkuberades vid 
50 °C i 7 dagar. Efter avslutad tillväxt tillsattes 5-10 ml autoklaverad Tween 80-lösning 0,05 % 
till varje platta för att frigöra de bildade sporerna. Med hjälp av en rackla skrapades sporer av 
från PDA-plattan. Lösningen pipetterades över till ett 50 ml-provrör och utgjorde sporlösningen 
som senare användes för inokulation av flytande kulturer och SSF-odlingar.  



	 	 	
	

12	
	

Ett litet prov av sporlösningen användes för räkning av sporer i Neubauer improved-
räknekammare under ett mikroskop, för att bestämma koncentrationen av sporer. Efter tillväxt 
används sporlösningen för att med känd mängd sporer inokulera andra odlingar. Sporlösningen 
från PDA-plattorna förvarades i kylskåp vid 4 °C. För att bevara kulturen på längre sikt gjordes 
35 % -glycerollösningar, där 875 µl glycerol blandades med 1625 µl sporlösning och placerades 
i frysen vid -20 °C. 

3.2 Odling av S. thermophilum på olika kolkällor 
En odling av mikroorganismer behöver medium med näringsämnen och spårämnen. Ett 
minimalt medium användes, då det var viktigt att exakt känna till vilka näringsämnen svampen 
hade att tillgå. Ingredienser till minimalmedium vägdes upp och blandades. 4 g KH2PO4, 13,6 g 
(NH4)2SO4, 0,8 g CaCl2·2H2O, 0,6 g MgSO4·7H2O, 6 g Bacto Peptone till 1 liter MilliQ®-vatten 
lösningen autoklaverades. Spårämneslösning tillreddes separat, 100 mg FeSO4·7H2O, 32 mg 
MnSO4·H2O, 28 mg ZnSO4·7H2O, 40 mg CoCl2·6H2O och 0,4 mg CuSO4·5H2O till 100 ml 
MilliQ®-vatten. 10 ml av spårämneslösningen tillsattes 1 liter av minimalmediet (Peciulyte et 
al., 2014). Det minimalmediet som bereddes innehöll allt svampen behövde för tillväxt förutom 
energi- och kolkälla, som tillsattes separat i varje experiment. Den totala halten av kolkälla ska 
enligt protokollet utgöra ungefär två volymprocent av lösningen (Peciulyte et al., 2014). 

De kolkällor som testades var galaktomannan, cellulosa, xylan, vetekli, barkpulver från gran och 
träpulver från gran. 

3.2.1 Flytande odling   
 De flytande kulturerna preparerades genom att tillsätta 0,5 g kolkälla i en 250 ml E-kolv med 
bafflar för bättre omblandning och därmed bättre syresättning. E-kolven med kolkällan 
autoklaverades för att undvika kontamination. Därefter tillsattes 25 ml minimalmedium samt 3 
ml sporlösning. E-kolven placerades i en skakinkubator så tillväxt kunde ske vid 50 °C och 150 
rpm i sju dagar. Till alla kulturer i E-kolv användes en porös kork som tillät luft passera. 
Skakinkubatorn hade genomskinliga väggar för ljusgenomsläpp. För att undvika att kolkälla och 
sporer fastnade på E-kolvens väggar, genomfördes regelbundna kontroller av odlingarna under 
tillväxtperioden, då försök gjordes att få ner material som fastnat på kärlets väggar. För att 
erhålla mer statistiskt säkerställda resultat förbereddes två biologiska replikat av varje odling.  

I de sista odlingarna som genomfördes användes dubbla mängden av kolkälla, minimalmedium 
och mängd sporer i en 500 ml E-kolv för att få ut en större volym enzymlösning. 

3.2.2 SSF-odling 
Liksom den flytande odlingen använder sig SSF-odlingen av minimalmedium och olika typer av 
kolkällor. SSF är en odling där organismer växer på fast massa. Till skillnad från den flytande 
odlingen kommer sporerna i SSF att växa utan omskakning. Detta odlingssätt efterliknar mer 
naturliga förhållanden för svampen jämfört med den flytande odlingen, vilket kan resultera i 
högre enzymkoncentration (Kachlishvili, Penninckx, Tsiklauri, & Elisashvili, 2006). 

SSF-odlingarna förbereddes genom att tillsätta 4 g kolkälla i en 125 ml E-kolv utan bafflar som 
därefter autoklaverades. Efter autoklaveringen tillsattes cirka 12 ml näringsmedium samt 3 ml 
sporlösning. E-kolven inkuberades därefter i ugn vid 50 °C i sju dagar. Odlingarna följdes upp 
regelbundet under odlingsperioden för att undvika uttorkning. Till odlingar som ansågs vara för 
torra tillsattes ytterligare medium. För att erhålla mer statistiskt säkerställda resultat förbereddes 
två biologiska replikat av varje odling.  



	 	 	
	

13	
	

3.3 Enzymextraktion ur biomassa 
Då tillräcklig tillväxt uppnåtts i den flytande kulturen överfördes odlingen till ett 50 ml-provrör 
och centrifugerades vid 4500 rpm i 5 minuter för att bli av med celler och stora partiklar från 
kolkällan. Supernatanten dekanterades över i en bägare. Lösningen drogs upp i engångsspruta 
och filtrerades genom nylonfilter med porstorlek 45 µm. 

Till SSF-odlingen tillsattes 25 ml MilliQ®-vatten till respektive E-kolv och placerades därefter i 
en skakinkubator i en halvtimme. Därefter filtrerades innehållet genom ett Miracloth-filter i en 
büchnertratt. Lösningen filtrerades därefter ytterligare genom ett nylonfilter med porstorleken 45 
µm. Efter filtrering kommer supernatanten främst innehålla proteinblandningen för just den 
kolkällan (Kachlishvili et al., 2006). De erhållna lösningarna kallas hädanefter enzymlösningar, 
och de förvarades i kylskåp vid 4 °C.  

3.4 Enzymanalys 
Projektets metoder för enzymanalys är spektrofotometriska och använder ämnen med kromofora 
funktionella grupper, till exempel aromatring eller dubbelbindningar (Grimm, Porra, Rüdiger, & 
Scheer, 2006).  

3.4.1 Mätning av proteinkoncentration 
För att mäta totala mängden protein som utsöndrats av svampen kan Bradfordanalys utföras. 
Bradfordanalys ger en snabb och enkel uppskattning av proteinkoncentrationen i en lösning 
genom att ett färgämnes absorptionsmaximum ändras då det ospecifikt binder till protein 
(Bradford, 1976).   

För att få en standardkurva som relaterar proteinkoncentation till absorbans, tillreddes en 
spädningsserie med kända koncentrationer av bovint serumalbumin, BSA (ThermoFisher 
Scientific). Koncentrationerna som tillreddes var 0, 25, 125, 250, 500 och 750 µg/ml. Därefter 
togs 10 µl av varje spädning samt ett blankprov i triplikat och 200 µl Bradfordreagens 
(ThermoFisher Scientific) och överfördes till en 96-brunns mikrotiterplatta (Sarstedt). Plattan 
inkuberades i 10 minuter i rumstemperatur och absorbansmätning genomfördes vid 595 nm. En 
standardkurva plottades i Excel och en ekvation för att översätta absorbans till koncentration 
erhölls.  

Enzymlösningar från odlingar av S. thermophilum på olika kolkällor användes därefter för 
mätningar av proteinkoncentration. Proverna behandlades enligt samma protokoll som 
standardkurvan enligt ovan. Proteinkoncentrationen i proverna beräknades med hjälp av 
standardkurvans relation mellan absorbans och koncentration.  

3.4.2 Koncentrationsmätningar på reducerande sockerändar 
Enzymaktiviteten i de erhållna enzymlösningarna, kan fastställas genom att mäta antalet 
reducerande sockerändar. De bildas då enzym klipper långa kolhydratkedjor i mindre bitar, där 
varje klipp ger en reducerande ände. Den reducerande änden kan detekteras med ett aromatiskt 
ämne, 3,5-dinitrosalicylsyra, förkortat DNSA. Sockermolekylens reducerande ände reagerar 
med DNSA vid 90 °C, varmed DNSA reduceras till 3-amino-5-nitrosalicylsyra, ANSA. ANSA 
är ett rödbrunt ämne med absorptionsmaximum vid 575 nm, som kan användas för detektion i 
spektrofotometer (Miller, 1959). Metoden är billig, snabb och enkel att utföra. Det som talar 
emot den är att den inte alltid är specifik utan kan ge utslag för andra reducerande ämnen än 
sockerarter som kan omvandla DNSA till ANSA. DNSA-metoden mäter ospecifikt endo- och 
exoaktivitet, då ett klipp i en sockermolekyl ger en reducerande och en icke-reducerande ände 
oavsett om klippet är i mitten eller i änden av en lång sockerkedja (McKee, 2017).  



	 	 	
	

14	
	

En stamlösning bereddes med 1 viktsvolym-% dinitrosalicylsyra, DNSA, 0,2 viktsvolym-% 
fenol och 1 viktsvolym-% natriumhydroxid, NaOH. Ingredienserna blandades i ett dragskåp, då 
de ingående ämnena är skadliga och stor försiktighet iakttogs. Den färdiga lösningen förvarades 
i rumstemperatur i skydd mot ljus. Fenol är ett giftigt, frätande ämne som är potentiellt skadligt 
att arbeta med. Anledningen till att detta ämne ingår i stamlösningen är att det femdubblar 
färgomslaget i lösningen och ökar analysmetodens upplösning (Miller, 1959).  

En standardkurva som relaterade absorbansen med koncentrationen reducerande sockerändar 
erhölls genom att lösa 1,0 g D-glukosmonohydrat i 100 ml MilliQ®-vatten så att 
slutkoncentrationen blev 10 mg/ml. Från denna stamlösning bereddes en spädningsserie med 
koncentrationerna 0, 50, 100, 500, 750, 1000, 1500 samt 2500 µg/ml. 400 µl av varje spädning 
överfördes till ett eppendorfrör och 400 µl DNSA-lösning tillsattes. Eppendorfrören inkuberades 
vid 90 °C i 20 minuter, för att låta reaktionen för färgomslag ske och kyldes därefter på is i 5 
minuter. Triplikat av proven tillsattes sedan till brunnar på en mikrotiterplatta och 
absorbansmätning genomfördes vid 575 nm.  

Standardkurvan är enbart gjord på glukos, vilket är lämpligt till försök där cellulosa används 
som substrat, då cellulosa är en polysackarid uppbyggd av enbart glukos-molekyler. För att få 
mer exakta resultat borde standardkurvan i varje undersökning anpassas efter vilken 
polysackarid som används som substrat. När xylan är substrat i DNSA-reaktionen borde således 
standardkurvan vara gjord på xylos (McKee, 2017), vilket inte utfördes i denna studie.  

Fyra stycken 10 ml enzymsubstratlösningar bereddes genom att tillsätta antingen 100 mg 
mikrokristallin-cellulosa eller 50 mg xylan, galaktomannan eller vetekli till 15 ml provrör. 
Därefter tillsattes MilliQ®-vatten så att volymen 10 ml erhölls. Slutkoncentrationerna av 
enzymsubstratlösningarna blev 10 mg/ml för cellulosalösningen och 5 mg/ml för xylan-, 
mannan- och veteklilösningarna. Till eppendorfrör tillsattes 50 µl av aktuell enzymlösning och 
450 µl enzymsubstratlösning i duplikat. Ett prov sattes direkt i frysen som ett nollprov, och det 
andra provet inkuberades vid 50 °C och omskakning över natt för att få de svårlösta 
enzymsubstraten att fördelas i provet. För vetekli visade det sig omöjligt att få samma mängd i 
varje rör med nämnda förfarande. För dessa prover vägdes 2,25 mg vetekli upp i varje 
eppendorfrör och 450 µl MilliQ®-vatten tillsattes, därefter tillsattes 50 µl enzymlösning. 

Efter inkubering eller förvaring i frys, tillsattes lika volym DNSA-lösning (500 µl) för att stoppa 
den enzymatiska nedbrytningen av enzymsubstratet. Därefter kokades proverna på värmeblock i 
90 °C i 20 minuter och kyldes sedan på is. 200 µl av både inkuberade prover och nollprover från 
frysen överfördes till mikrotiterplatta i triplikat och absorbans mättes i spektrofotometer vid 575 
nm. Värdena jämfördes med standardkurvan vid analys.  

Vid tidsstudie utfördes laborationen enligt ovan med ett rör för varje inkuberingstid: 0, 10, 30, 
60, 90, 120, 180, 240 och 300 minuter. Vid temperaturmätning utfördes laborationen enligt ovan 
vid 60 °C och sedan 70 °C med ett rör för varje inkuberingstid: 0, 10, 30, 60 och 180 minuter. 

Figur 11 visar ett översiktligt flödesschema där det går att följa tillvägagångssättet för DNSA-
analys. 



	 	 	
	

15	
	

 
 

Figur 11. Översiktligt flödesschema som visar tillvägagångssättet för DNSA-analys. 

 
3.4.3 Aktivitetsmätningar på syntetiska substrat 
En metod för att mäta aktiviteten hos enzym är para-nitrofenolanalys, så kallad pNP-analys. 
Resultatet från pNP-mätningar visar om en specifik enzymaktivitet förekommer. Det finns en 
mängd olika pNP-substrat att tillgå kommersiellt. Då enzymet klipper isär den aktuella 
bindningen frigörs pNP som vid basiska pH har en kraftigt gul färg. Intensiteten i färgen 
detekteras med hjälp av en spektrofotometer. Ett substrat testas åt gången och om 
enzymblandningen klyver bindningen mellan sockret och pNP-molekylen ger det färgutslag. 
Slutsatsen blir då att ett enzym med den aktuella aktiviteten som testats för finns i provet. 
Eftersom sockermolekylen är bundet direkt till pNP-molekylen kan metoden endast användas 
för att påvisa exoaktivitet hos enzym. (Bowers, McComb, Christensen, & Schaffer, 1980). Detta 
ger information om vilken klass av enzym blandningen innehåller.  

En basisk natriumkarbonat-stopplösning, Na2CO3, pH>11 med koncentrationen 1 M tillreddes 
från salt. Då molmassan för Na2CO3 är 105,98 g/mol, tillsattes 21,2 g Na2CO3-salt till en 
rundkolv. Därefter tillsattes MilliQ®-vatten så att den slutgiltiga volymen i rundkolven blev 200 
ml.  

Citratfosfatbuffert tillreddes genom att blanda lösningar av citratsyramonohydrat, C6H8O7·H2O, 
och dinatriumfosfat, Na2PO4. Av citratsyramonohydrat med molvikten  
210,14 g/mol vägdes 10,505 g upp i en rundkolv och MilliQ®-vatten tillsattes upp till 500 ml, 
för att erhålla 0,1 M lösning. Av dinatriumfosfat med molmassan 141,98 g/mol vägdes 14,2 g 
upp i en rundkolv och MilliQ®-vatten tillsattes upp till 500 ml så en 0,2 M lösning erhölls. De 
båda lösningarna blandades samtidigt som pH mättes till pH 6,0. Det krävdes ungefär dubbelt så 
stor volym av dinatriumfosfatlösningen som av citratsyramonohydratlösningen.    

En stamlösning med 10 mM pNP blandades. Från pNP-pulver med molmassan 139,1 g/mol 
vägdes 13,9 mg upp och 10 ml dimetylsulfoxid, DMSO tillsattes. Lösningen förvarades i  
–20 °C. En standardkurva som relaterade absorbansen med koncentrationen av fritt pNP erhölls 
genom att späda pNP-stamlösningen till koncentrationerna 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 och 150 
µM. Stamlösningen späddes med citratfosfatbufferten. Av varje spädning överfördes tre 



	 	 	
	

16	
	

tekniska replikat om 100 µl till en mikrotiterplatta. Därefter adderades 100 µl natriumkarbonat-
stopplösning till varje brunn och absorbansen mättes i en spektrofotometer vid 410 nm.  

För aktivitetsmätning av de olika enzymlösningarna gjordes tre tekniska replikat. 200 µl 100 
mM natriumfosfatbuffert, 80 µl MilliQ®-vatten, 80 µl enzymlösning och 40 µl pNP-substrat av 
varje kombination av enzymlösning och pNP-substrat blandades i duplikat i två eppendorfrör, 
ett för inkubering och ett för förvaring i frys. Samtliga enzymprover förvarades på is tills alla 
prover blivit klara. Därefter sattes hälften av rören i ugn och inkuberades vid 50 °C i 18 timmar. 
Den andra hälften av proverna förvarades i frysen och användes som referenser, dessa benämns 
nollprover. Efter inkuberingen överfördes 100 µl natriumkarbonat-stopplösning till varje brunn 
som användes i en mikrotiterplatta. Därefter pipetterades 100 µl av enzymproven i triplikat till 
brunnarna på mikrotiterplattan och innehållet i brunnen blandades väl genom pipettering. 
Absorbansen mättes vid 410 nm. Figur 12 visar ett översiktligt flödesschema där det går att följa 
tillvägagångssättet som använts för pNP-analys i detta projekt.  

 

Figur 12. Översiktligt flödesschema som visar tillvägagångssättet som använts för pNP-analys i detta projekt.  
 

Nio olika pNP-substrat, alltså monosackarider bundna med pNP (α - och β-D-galaktos, α- och β-
D-mannos, α- och β-D-glukos, α- och β-D-xylos och α-L-arabinos), användes i en översiktsstudie. 
Samtliga pNP-substrat testades med enzymlösningar från samtliga sex kolkällor (vetekli, 
galaktomannan, xylan, cellulosa, träpulver från gran och barkpulver från gran). Var och en 
odlades också med två olika metoder, flytande kultur och SSF, för att se vilka kombinationer 
som gav högst aktivitet.  

Efter denna förstudie valdes den bästa odlingsmetoden och de bästa kolkällorna ut för vidare 
studier. Vid tidsstudie utfördes laborationen enligt ovan med ett rör för varje inkuberingstid: 0, 
10, 30, 60 och 120 minuter.  

  



	 	 	
	

17	
	

4. Resultat och analys 
I detta avsnitt presenteras de resultat som erhållits under projektet. Först presenteras resultat från 
odlingar som genomförts under projektet. Därefter presenteras resultat från Bradfordanalyser 
som visar uppmätta proteinkoncentrationer i enzymlösningar extraherade från odlingar. Därefter 
presenteras resultat från aktivitetsmätningar utförda med pNP- och DNSA-metoden. Resultaten 
från aktivitetsmätningar presenteras först för översiktsförsök där en större mängd olika kolkällor 
och enzymsubstrat testades. Därefter presenteras resultat från aktivitetsmätningar som 
genomförts regelbundet under en viss tidsperiod, dessa mätningar benämns tidsmätningar. Sist 
presenteras resultat från DNSA-analys som genomförts vid temperaturerna 50 °C, 60 °C och 70 
°C, dessa mätningar benämns temperaturmätningar.  

4.1 Odlingar 
Flera odlingar genomfördes under projektets gång. Figur 13 visar de olika odlingstyper som har 
använts under projektet. Svampen bildar svarta kolonier.  

 

Figur 13. A. PDA-plattor. B. Flytande kulturer. C. Flytande kulturer i inkubator. D. SSF-odling. Samtliga bilder är 
fotograferade under projektets gång. 

Figur 13A visar PDA-plattor där tillväxt av svampen har pågått under en vecka. Det framgick att 
svampen hade god tillväxt på potatisdextrosagar. Figur 13A visar att mängden bildade 
svampsporer varierade mellan de olika plattorna. I majoriteten av fallen krävdes en veckas 
odling för att få plattor med tillräckligt mycket svamp för att bereda sporlösning för inokulering 
av flytande kulturer och SSF-odlingar. 

Figur 13B visar flytande kulturer med kolkällorna galaktomannan respektive xylan. Det framgår 
tydligt av figuren att svampen har växt på E-kolvens väggar för de odlingar med galaktomannan 
som kolkälla. Det svarta på kanterna är svampens bildade sporer. Figur 13C visar flytande 
kulturer placerade i en skakinkubator. Det framgick att de flytande kulturerna innehöll svampen 



	 	 	
	

18	
	

då mängden svarta sporer ökade under tillväxtfasen. Figur 13D visar en bild av en SSF-odling, 
för dessa odlingar kunde svampen identifieras växa på ytan av kolkällan.  

Under odlingsprocessen upptäcktes för- och nackdelar med både flytande kulturer och SSF-
odlingarna. Ett problem som uppstod med de flytande kulturerna var att det fastnade partiklar av 
kolkälla på E-kolvens väggar, något som orsakades av omskakningen i inkubatorn, eftersom 
vätskenivån under omskakning precis nådde upp till randen svampkolonier och försedde den 
med näring. Det upptäcktes att några av SSF-odlingarna hade en tendens att torka ut under 
inkuberingen. För att undvika detta tillsattes mer vätska till torra odlingar. Eftersom flytande 
kulturer gav bättre resultat presenteras enbart data för flytande kulturer hädanefter i rapporten.  

4.2 Bradfordanalys  
Proteinkoncentrationer i µg/ml för enzymlösningarna extraherade från de odlingar som 
genomfördes vid översiktsförsöken visas i Figur 14. Dessa odlingar innehöll kolkällorna 
cellulosa, vetekli, trä, bark, galaktomannan respektive xylan. Standardkurva för Bradford ses i 
Bilaga 1. 

 

Figur 14. Resultat från Bradfordanalys av enzymlösningar från alla använda kolkällor med felmarginaler utritade.  

Det framgår från Figur 14 att enzymlösningen från odlingen med cellulosa hade högst 
proteinkoncentration. Lägst proteinkoncentration hade enzymlösningen från odlingen med 
vetekli som kolkälla. Enzymlösningarna från odlingarna med trä, bark, galaktomannan och 
xylan hade liknande proteinkoncentrationer.  

Proteinkoncentrationer i µg/ml i enzymlösningar extraherade från senare odlingar med trä, 
vetekli och galaktomannan visas i Figur 15. Bradfordanalys genomfördes för två biologiska 
replikat av varje odling.  

 

 



	 	 	
	

19	
	

 

Figur 15. Proteinkoncentrationer i två biologiska replikat av enzymlösningar från odlingar med kolkällorna trä, 
vetekli och galaktomannan, med felmarginaler utritade. De blå staplarna visar resultatet för biologiskt replikat 1, 
och de röda visar resultatet för biologiskt replikat 2.  

Det framgår av Figur 15 att proteinkoncentrationerna i de biologiska replikaten var 
förhållandevis lika. Figur 15 visar även att skillnaden i proteinkoncentration mellan 
enzymlösningar från odlingar med olika kolkällor var små.  

En jämförelse av resultaten i Figur 14 och Figur 15 visar att enzymlösningar från olika odlingar 
med kolkällorna trä och galaktomannan innehöll relativt lika proteinkoncentrationer. Det 
framgår att proteinkoncentrationerna i enzymlösningar från vetekliodlingarna skiljer sig mycket 
åt. Denna skillnad kan tyda på något problem med den första kulturen av vetekli som gjordes, 
t.ex. att odlingen inokulerades med en för liten mängd sporer. 

4.3 Aktivitetsmätningar över natt 
Aktivitetsmätningarna i översiktsförsöken utfördes för att avgränsa projektet ytterligare genom 
att välja bort kolkällor som genererade enzymlösningar med låg aktivitet. Även enzymsubstrat 
för pNP- och DNSA-analys som bedömdes intressanta för fortsatta studier valdes ut. Vid de 
inledande försöken användes enzymlösningar från samtliga kolkällor som valdes vid projektets 
start. Enzymlösningarna undersöktes med både pNP- och DNSA-analys i försök där 
enzymlösningar och enzymsubstrat inkuberades i 18 timmar under en natt. Dessa försök 
genererade stora mängder data, övernattsdata, som för pNP-analysen presenteras i Figur 23 i 
Bilaga 2. Det framgick att aktiviteten skiljde mycket mellan olika kombinationer av 
enzymlösningar och pNP-substrat. Lägst aktivitet erhölls från enzymlösningar från odlingar med 
kolkällorna bark, trä och cellulosa, se Figur 23 i bilaga 2. I dessa mätningar utmärkte sig vetekli 
och galaktomannan som bra kolkällor då de gav enzym som hade hög aktivitet. Flera av 
resultaten som indikerar hög aktivitet, exempelvis aktivitet på pNP-β-D-xylos, är inte exakta då 
de uppmätta absorbansvärdena ligger utanför det linjära området på standardkurvan för pNP. 
Detta innebär att de befinner sig i ett område där sambandet mellan absorbans och koncentration 
av pNP är okänt. Därför kan inte exakta värden på aktiviteten beräknas utifrån värden på den 
framtagna standardkurvan som ses i Figur 21 i Bilaga 1. Även om aktiviteterna som visas i 
Figur 23 i Bilaga 2 inte är exakt ger den ändå en bra indikation på vilka kolkällor och 
enzymsubstrat som gav en hög aktivitet. De pNP-substrat som gav bra resultat vid dessa 



	 	 	
	

20	
	

mätningar var aktivitet på pNP-β-D-xylos, β-D-glukos, α-D-mannos och α-D-arabinos. Dessa 
pNP-substrat valdes därför ut för vidare studier.  

Övernattsdata som genererades från DNSA-mätningar presenteras i Figur 24 i Bilaga 2. Även 
vid dessa mätningar gav olika kombinationer av enzymlösningar och enzymsubstrat olika 
aktiviteter. Enzymlösningar från odlingar med kolkällorna trä, vetekli och cellulosa 
observerades ha högst aktiviteter. Vid val av kolkällor för vidare studier togs både pNP- och 
DNSA-resultat i beaktning. Av denna anledning valdes kolkällorna vetekli, galaktomannan och 
trä för vidare analys. Då enzymlösningar från odlingar med kolkällan trä uppvisat relativt låg 
aktivitet vid pNP-analys motiverades valet ytterligare med att trä är en komplex kolkälla som 
ansågs viktig med tanke på projektets syfte att ta fram enzym som bland annat skulle kunna 
användas inom industrin för att omvandla restmaterial från skogsindustrin.  

Efter de initiala aktivitetsmätningarna togs beslutet att genomföra ytterligare övernattsmätningar 
med metoderna pNP- och DNSA-analys. Denna gång undersöktes endast enzymlösningar från 
de kolkällor och pNP-substrat som valts ut baserat på tidigare resultat. Kolkällorna som 
användes var galaktomannan, vetekli och trä och de testades med pNP-substraten pNP-α-D-
arabinos, β-D-xylos, β-D-glukos och α-D-mannos. Dessa försök gjordes för att bekräfta tidigare 
resultat och se att de nya odlingarna fick liknande värden. Vid försöken användes 
enzymlösningar från två biologiska replikat som i medel varierade med 10 procent. Resultaten 
från försöken visade att samtliga hade god aktivitet. Åtta av proverna översteg maskinens 
mätintervall för absorbans. Detta indikerar att de har en hög koncentration av fritt pNP och 
därmed en hög aktivitet. På grund av projektets tidsbegränsning eliminerades ett antal 
kombinationer av kolkällor och pNP-substrat som gett relativt låga resultat. Av denna anledning 
valdes alla kombinationer innehållande pNP-α-D-arabinos och kombinationen trä med pNP-α-D-
mannos bort. En motivering till att göra dessa avgränsningar var hypotesen att dessa 
kombinationer trots den höga aktiviteten efter en övernattsmätning inte skulle ge lika hög 
aktivitet under kortare tidsmätningar som genomfördes under projektets andra del.  

Resultat från övernattsmätningarna med DNSA-analys utfört på enzymlösningar från odlingar 
med kolkällorna galaktomannan, vetekli och trä, visas i Figur 16.  

 

 



	 	 	
	

21	
	

 

Figur 16. Övernattsdata från DNSA-analys där två biologiska replikat analyserats. Felmarginaler är utmarkerade. 
Asterixerna visar de fall vars resultat överskred vad som kunde beräknas med standardkurvans ekvation. De blå 
staplarna visar resultat för biologiskt replikat 1 och de röda visar resultatet för biologiskt replikat 2.  

Även i detta fall uppvisar de biologiska replikaten stora likheter gällande enzymatisk aktivitet. 
För denna analysmetod finns det också fall där de beräknade aktiviteterna överstiger de 
aktivitetsvärden som motsvarar det största aktivitetsvärde som kan beräknas med 
standardkurvans ekvation, se Bilaga 1. Värden som översteg en koncentration av 1,5 mg/ml i 
reducerande sockerändar är utanför standardkurvans ekvation, vilket i Figur 16 blir kolkälla 
galaktomannan på enzymsubstrat galaktomannan och xylan, kolkälla vetekli på enzymsubstratet 
xylan samt kolkälla trä på enzymsubstrat galaktomannan och trä. 

4.4 Koncentrationsmätningar vid tidsuppföljning 
För vidare analys av de intressanta enzymsubstraten utfördes koncentrationsmätningar av fritt 
pNP och reducerande sockerändar regelbundet under en tidsperiod på totalt 120 minuter för 
pNP-analys och 300 minuter för DNSA-analys. Två biologiska replikat undersöktes med 
metoderna. I Figur 17 presenteras data från koncentrationsmätning av fritt pNP i mM i 
enzymlösningar från två biologiska replikat med kolkällorna vetekli, trä och galaktomannan. 
 
  



	 	 	
	

22	
	

 

 
Figur 17. Tidskurvor för koncentrationsmätning av fritt pNP i mM från enzymatisk klyvning av pNP-substrat. 
Koncentrationen av pNP i mM visas mot tiden i minuter. Enzymlösningar från odlingar med vetekli, trä och 
galaktomannan testades på pNP-substraten pNP-β-D-xylos, pNP-β-D-glukos respektive pNP-β-D-mannos. I A, B 
och C ses det biologiska replikatet 1 och i D, E och F ses biologiska replikat 2. I A och D är det vetekli som är 
kolkälla, i B och E är det Trä och i C och F är det galaktomannan. I figuren representeras pNP-β-D-xylos med en 
blå heldragen linje, pNP-β-D-glukos representeras av röd prickad linje och pNP-β-D-mannos representeras med en 
grön streckad linje. Felmarginaler representeras av lodräta felstaplar.  

Det framgår av Figur 17 att koncentrationsmätningarna gav liknande resultat för de biologiska 
replikaten. Av denna anledning kommer endast data från det första biologiska replikatet att 
presenteras hädanefter. Det framgår av figuren att både enzymlösningar från vetekli och trä gav 
koncentrationer av frigjort pNP på omkring 0,8 mM då de användes på pNP-β-D-glukos. 
Eftersom pNP-metoden mäter intensiteten från ett färgomslag orsakat av den mängd pNP som 
kluvits bort av från pNP-substratet är det inte sannolikt att koncentrationen av pNP kan minska 
på ett sådant sätt som visas mellan tidpunkt 60 och 120 minuter i Figur 17C. Det frigjorda pNP 
kommer inte att binda tillbaka till substratet som nu är kluvet och därför bör en minskad 
enzymatisk aktivitet visas som en konstant koncentration av pNP. Därför är mätvärdet vid 60 
minuter för enzym från galaktomannan och pNP-β-D-xylos sannolikt felaktigt. Samtliga 
enzymlösningar gav liknande koncentrationer av frigjort pNP för pNP-β-D-xylos. Det kromofora 
substratet pNP-β-D-mannos testades bara med enzymlösningarna vetekli och galaktomannan och 
gav förhållandevis låga koncentrationer av fritt pNP för båda.  

Tidsmätningar utfördes även med DNSA-analys vid inkuberingstemperatur 50 °C. Figur 18 
presenterar data från koncentrationsmätningar av reducerande sockerändar i mg/ml för det första 
biologiska replikaten med kolkällorna vetekli, trä och galaktomannan. 

  



	 	 	
	

23	
	

 

Figur 18. Tidskurvor för koncentrationsmätning av reducerande sockerändar i mg/ml från enzymatisk klyvning av 
enzymsubstrat. Koncentrationen av reducerande sockerändar i mg/ml visas mot tiden i minuter. Enzymlösningar 
från odlingar med A. vetekli, B. trä och C. galaktomannan testades på enzymsubstraten xylan och galaktomannan i 
vardera graf. I figuren representeras xylan av en blå prickad linje och galaktomannan representeras av en heldragen 
grön linje. Felmarginaler representeras av lodräta felstaplar.  

Det framgår av Figur 18 att samtliga enzymlösningar gav lägre koncentrationer av reducerande 
sockerändar då de bryter ner galaktomannan. Enzymlösningen från odling med vetekli på xylan 
tenderar att plana ut i slutet av mätperioden. Reaktionerna mellan enzymlösningar från trä och 
xylan och galaktomannan fortsätter någorlunda linjärt under hela mätperioden. Samma gäller 
även för graferna för galaktomannan. Grafen för enzymlösningen från galaktomannan visar ett 
kraftigt avvikande värde vid tidpunkt 90 minuter för enzymsubstratet galaktomannan.       

4.5 Koncentrationsmätningar vid temperaturökning 
För att studera enzymlösningarnas värmestabilitet genomfördes koncentrationsmätningar av 
reducerande sockerändar med DNSA-analys vid olika temperaturer. Vid dessa mätningar höjdes 
temperaturen vid inkuberingen av enzymlösningar och enzymsubstraten. De 
temperaturhöjningar som genomfördes var 60 °C och 70 °C. För att se om enzymen 
överhuvudtaget tålde högre temperaturer genomfördes temperaturmätningar för fyra mätpunkter 
under 180 minuter. Figur 19 visar koncentrationen av reducerande sockerändar i mg/ml mot 
tiden i minuter. I diagrammen har koncentrationer från tidigare presenterade mätningar vid 
inkuberingstemperaturen 50 °C infogats.  



	 	 	
	

24	
	

 

 



	 	 	
	

25	
	

 

Figur 19. Tidskurvor erhållna vid koncentrationsmätning av reducerande sockerändar vid olika temperaturer. 
Koncentrationen av reducerande sockerändar i mg/ml visas mot tiden i minuter. Enzymlösningar från odlingar med 
A. vetekli med enzymsubstrat xylan, B. vetekli med enzymsubstrat galaktomannan, C. trä med enzymsubstrat 
xylan, D. trä med enzymsubstrat galaktomannan, E. galaktomannan med enzymsubstrat xylan samt F. 
galaktomannan med enzymsubstrat galaktomannan. I figuren representeras temperaturen 50 °C med en blå prickad 
linje, 60 °C representeras en grön heldragen linje och 70 °C representeras med en röd streckad linje. För samtliga 
grafer är felmarginaler representerade av lodräta felstaplar. Notera de olika skalorna på axlarna i de olika 
diagrammen.  

Vid nedbrytning av xylan, som kan ses i Figur 19A, C och E, är det uppenbart att 
enzymreaktionerna gick snabbare vid 50 °C än vid både 60 och 70 °C i det initiala skedet. Att 
det gick snabbare vid 50 °C i början kan framförallt ses i Figur 19A och E. Vid tiden 30 minuter 
blir koncentrationen vid 70 °C högre än vid 50 °C och det är efter 30 minuter som 70 °C 
snabbast genererar en hög koncentration reducerande sockerändar vilket kan ses i alla de tre 
diagrammen som representerar nedbrytning av xylan. Den temperatur som genererar högst 
koncentration av reducerande sockerändar är 60 °C som har gått om både 50 °C och 70 °C 
grader då reaktionen fått stå ungefär 120 minuter.  

Nedbrytningen av Galaktomannan kan ses i figur 19B, D och F. För 19B ligger 50 och 60 °C på 
lika värden, i 19D ligger 60 °C något högre än vad 70 °C gör medan 50 °C ligger på 0 fram till 
30 minuter. I 19F ligger 50 °C och 70 °C på samma koncentrationer medan 60 °C visar lägre 
koncentrationer. Vid 30 minuter blir koncentrationen vid 70 °C högre än båda de andra 
temperaturerna och fortsätter att vara så i 19B. I 19D och E däremot går koncentrationen vid 60 
°C förbi 70 °C som planar ut. Det höga koncentrationsvärdet vid 90 minuter i Figur 19F är 
troligen ett felvärde. Koncentrationen av reducerande sockerändar ökar väldigt kraftigt här, bara 
för att sedan minska kraftigt. Detta är osannolikt då reducerande sockerändar sker irreversibelt. 



	 	 	
	

26	
	

 I förstoringarna i Figur 19 går det att se hur temperaturerna skiljer sig åt i början av 
tidsintervallet. I de flesta figurerna (dock ej Figur 19B) ses att koncentrationen reducerande 
sockerändar vid 60 °C blir högre än vid 70 °C efter ungefär 180 minuter. Detta kan tyda på att 
enzymen inte tål 70 °C en längre tid, vilket även stöds av att linjerna tenderar att plana ut för 70 
°C efter längre tid.  

  



	 	 	
	

27	
	

5. Diskussion   
För att uppfylla syftet har enzym producerade av S. thermophilum undersökts med 
spektrofotometriska metoder. Det som studerats är proteinkoncentration, och efter enzymatisk 
nedbrytning, koncentration av frigjort pNP och koncentration av reducerande sockerändar. 

En mängd åtgärder har utförts för att erhålla tillförlitliga resultat med små felmarginaler. Stora 
felmarginaler kan bero på felaktigt utförd omrörning eller pipettering. Vid odling utfördes två 
biologiska replikat, som i de flesta fall gav liknande resultat, se Figur 15 och 16. Detta tyder på 
att svampen odlades under likvärdiga förhållanden. Minst två tekniska replikat utfördes för varje 
Bradford-, DNSA- och pNP-analys under översiktsstudien. Replikaten gjordes för att kontrollera 
att proverna var korrekt tillredda och om pipetteringen utförts på samma sätt i alla provrör och 
brunnar. En känd brist hos DNSA-analyserna som har utförts är att endast en standardkurva 
baserad på glukoskoncentrationsmätningar har använts för att beräkna koncentrationen 
reducerande sockerändar för enzymsubstraten. Idealt hade varit att göra en standardkurva för 
varje enzymsubstrat, det bedömdes påverka i så liten omfattning att resultatet inte ändrats 
(McKee, 2017). Ett annat problem med metoden var att enzymsubstraten cellulosa, trä och 
vetekli är olösliga i vatten. Därför behövdes ordentlig omrörning för att enzymen skulle få 
möjlighet att bryta ner de enzymsubstraten i samma utsträckning som galaktomannan och xylan. 
Trots omrörning hade enzymsubstraten sedimenterat efter en natts inkubering, vilket kan ha gett 
lägre aktivitet då enzymen hade sämre tillgång till substratet.  
 
I översiktsstudien användes odlingsmetoderna flytande kultur och SSF-odlingar. 
I naturen växer svamp oftast på fasta material, det är därför rimligt att anta att SSF-odling skulle 
vara ett mer gynnsamt odlingssätt för svamp (Pandey, 2003). Resultatet från översiktsstudien, se 
Figur 13B, visar att svampen har god tillväxt ovanför vätskenivån hos en flytande kultur. Det 
framgår att tillväxten på kanten av E-kolven är betydligt kraftigare än tillväxten i vätskefasen. 
Där var fuktigheten hög samtidigt som svampen kunde växa på en fast yta. Detta indikerar att 
svampen föredrar tillväxt på fasta material. En liten vätskevolym ger en förhållandevis stor 
avdunstning vid 50 °C. Av denna anledning torkade flera av SSF-odlingarna som genomfördes 
under projektet. Detta innebar problem då samtliga odlingar inte kunde behandlas enligt samma 
protokoll, därför valdes detta odlingssätt bort. Resultatet med kraftig tillväxt på kanten av e-
kolven indikerar dock att SSF-odlingar kan vara intressanta för framtida forskning. Ett protokoll 
med optimal mängd näring, fuktighet samt tillväxtstid hade då kunnat tas fram.   
 
Resultaten från koncentrationsmätning av reducerande sockerändar efter 18 timmars 
enzymreaktion, se Figur 16, visar att enzymlösningarna från galaktomannan, vetekli och trä 
samtliga har god aktivitet på xylan. Detta tyder på att svampens produktion av xylanaser har 
triggats av tillväxt på dessa kolkällor. Att svampen producerar xylanas stämmer bra överens 
med tidigare studier, där xylanasgener påträffats hos andra stammar av S.thermophilum 
(Boonlue et al., 2003). En parallell kan dras till aktiviteten för galaktomannan, då tidigare 
studier visat att andra stammar av svampen har producerat mannanas (Jatinder, Chadha, & Saini, 
2006). Det framgick även av resultaten i Figur 16 att enzymlösningarna från kolkällorna 
galaktomannan, vetekli och trä hade dålig aktivitet på cellulosa. Det finns flera tänkbara 
anledningar till detta. Som nämnts tidigare krävs många olika typer av enzymaktiviteter för att 
kunna bryta ner cellulosa. Det är möjligt att de erhållna enzymlösningarna inte innehöll 
tillräckliga aktiviteter för nedbrytning. Det är särskilt anmärkningsvärt att enzymlösningen från 
odlingen med trä inte kan bryta ner cellulosa. En tänkbar förklaring är att trä är ett komplext 
material som innehåller många andra komponenter som kan påverka svampens uttryck av 
cellulaser. Hemicellulosor är lättare att bryta ner än cellulosa på grund av den senares kristallina 



	 	 	
	

28	
	

struktur (Henriksson & Lennholm, 2009). Det är därför troligt att svampen i första hand vill 
tillgodogöra sig näring från hemicellulosorna xylan och galaktomannan som också finns i trä.  
 
Resultaten från mätningar av reducerande sockerändar vid 50 °C, se Figur 18, visar att det 
endast är reaktionen med enzymodling med vetekli och enzymsubstratet xylan som visar 
tendenser till att avstanna under tidsperioden 300 minuter. Det skulle vara intressant att studera 
de andra reaktionerna under en längre tid för att se hur länge enzymen är aktiva och se 
reaktionens slut. Det avvikande värdet för galaktomannan betraktas som felaktigt, där tänkbara 
orsaker är förväxling eller kontaminering av prov. Vid andra absorbansmätningar har enstaka 
extremvärden förekommit, de har ibland kunnat förklaras med att det funnits vattendroppar på 
mikrotiterplattans avläsningsyta, något som har åtgärdats genom att torka av plattan och läsa av 
den igen. I den aktuella punkten fungerar inte det som förklaringsmodell, då standardavvikelsen 
mellan replikaten inte är större än för andra mätpunkter.  
 
En genomgående trend hos resultaten från temperaturstudien, som visas i Figur 19, är att en 
högre aktivitet erhålls vid en högre temperatur. Vid 60 °C och 70 °C användes fyra mätpunkter 
under en tidsperiod på 180 minuter. Dataserier från mätningen vid 50 °C innehåller sex 
mätpunkter istället för fyra. Det är en nackdel att graferna för 60 °C och 70 °C har färre värden, 
det blir svårare att tyda trender från dessa data. En möjlig felkälla kan vara att mätningarna vid 
50 °C utfördes tidigare under projektet. Eftersom de inte utfördes samtidigt kan det ha funnits 
förhållanden som påverkat resultaten.   
 
Ett lyckat resultat för en enzymlösning visas i Figur 19B. Resultatet tyder på en stabil aktivitet 
under lång tid vid hög temperatur, hos enzymlösning från vetekli då det används med 
enzymsubstratet galaktomannan. Därför hade det varit mycket intressant att vidare undersöka 
enzym från odling på vetekli med galaktomannan som enzymsubstrat.  
 
I Figur 19A, C, D och E syns en gemensam trend där graferna för 70 °C verkar plana ut mot 
slutet av tidsperioden. En tänkbar förklaring kan vara att enzymet inte tål högre temperaturer 
under en längre tid utan denatureras. Det är olyckligt ur ett industriellt perspektiv, då enzym som 
förblir stabila under en längre tid är eftertraktade (Cherry & Fidantsef, 2003). En annan tänkbar 
anledning är att enzymen har brutit ner allt substrat. Det skulle visas som en konstant 
koncentration av reducerande sockerändar. Det framgår även att efter 180 minuter är 
koncentrationen högst vid 60 °C. Detta indikerar att 70 °C är en för hög temperatur om en stabil 
process vill erhållas. För att få mer entydiga resultat skulle det vara intressant att utföra 
mätningar vid fler tidpunkter. Det skulle vara intressant att utföra mätningar under längre tid än 
180 minuter. Särskilt intressant skulle det vara att undersöka när koncentrationen reducerande 
sockerändar planar ut vid 60 °C. Eftersom 60 °C visat bättre resultat än 70 °C för många 
enzymlösningar skulle det vara intressant att undersöka temperaturer i det intervallet kunnat 
undersökas för att hitta ett eventuellt optimum. Det hade även varit intressant att undersöka 
temperaturer högre än 70 °C för att se om det finns enzymaktiviteter som klarar det.   
  

  



	 	 	
	

29	
	

6. Slutsats 
Syftet med detta projekt var att undersöka värmestabiliteten hos enzym som producerats av 
stammen FCH 6.2 av S. thermophilum. Resultaten visar att enzym producerade av 
svampstammen har högre aktivitet vid temperaturerna 60 °C och 70 °C jämfört med 50 °C. Av 
denna anledning är svampstammen intressant för fortsatta studier av termofila enzym för 
nedbrytning av växtbiomassa. 
 
För att få reda på mer om vilka slags enzym svampen producerar finns en mängd metoder att 
tillgå. Med SDS-PAGE hade ytterligare information om producerade enzym kunnat erhållas. För 
att få intressant information från SDS-PAGE, kan en 2D-PAGE köras. Då proteinlösningen 
innehåller många olika protein, blir upplösningen högre om den separeras i två dimensioner. För 
att undersöka hur effektiva de utvunna enzymen är kan det vara intressant att jämföra dem med 
en kommersiell enzymblandning, för att få ett mått på hur effektiva S. thermophilum enzymen 
från är i jämförelse med etablerade enzymblandningar under samma förhållanden.  
 
I framtida studier hade det varit intressant att studera vilka gener som uttrycks hos  
S. thermophilum vid odling på olika kolkällor, vilket har utförts för andra svampstammar 
(Amore et al., 2013). För att studera genuttryck behöver svampstammens DNA först 
sekvenseras. Därefter kan transkriptomi användas för att studera vilka gener som uttrycks vid 
odling på olika kolkällor. När det är känt vilka gener som uttrycker effektiva enzym kan dessa 
uttryckas i en lämplig värdorganism. Därefter kan de producerade enzymen eventuellt användas 
i enzymblandningar. Vidare skulle det vara intressant att studera individuella enzym och deras 
egenskaper för effektiv nedbrytning av växtbiomassa.  

 
 
 
 

  



	 	 	
	

30	
	

Källförteckning  
  
Amore, A., Giacobbe, S., & Faraco, V. (2013). Regulation of cellulase and hemicellulase gene 

expression in fungi. Current Genomics, 14(4), 230–49. 
https://doi.org/10.2174/1389202911314040002 

Basotra, N., Kaur, B., Di Falco, M., Tsang, A., & Chadha, B. S. (2016). Mycothermus thermophilus 
(Syn. Scytalidium thermophilum): Repertoire of a diverse array of efficient cellulases and 
hemicellulases in the secretome revealed. Bioresource Technology, 222, 413–421. 
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.10.018 

Berrin, J.-G., Navarro, D., Couturier, M., Olivé, C., Grisel, S., Haon, M., Lesage-Meessen, L. (2012). 
Exploring the natural fungal biodiversity of tropical and temperate forests toward improvement of 
biomass conversion. Applied and Environmental Microbiology, 78(18), 6483–90. 
https://doi.org/10.1128/AEM.01651-12 

Blomstrand, E., Hartvigsson, O., Törnkvist, H., & Westling, A. (2016). Karaktärisering av tropiska 
svampar och deras enzymer. Göteborg. 

Boonlue, S., Aimi, T., & Morinaga, T. (2003). Molecular characterization of a xylanase-producing 
thermophilic fungus isolated from Japanese soil. Current Microbiology, 47, 119–124. 
https://doi.org/10.1007/s00284-002-3918-z 

Bradford, M. M. (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of 
Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72, 248–254. 

Calvaro. (2006). Glukos [Elektronisk bil]. Hämtad maj 10, 2017, från 
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2f/Glucose_equilibrium.png/799px-
Glucose_equilibrium.png 

Cherry, J. R., & Fidantsef, A. L. (2003). Directed evolution of industrial enzymes: an update. Current 
Opinion in Biotechnology, 14(4), 438–443. https://doi.org/10.1016/S0958-1669(03)00099-5 

Cox, K. (2014). Environmental life-cycle impact of alternative aviation fuels. Access Science. 
https://doi.org/10.1036/1097-8542.YB140408 

Demirbas, A. (2014). Bioethanol production (fungal enzymes). Access Science. 
https://doi.org/10.1036/1097-8542.900123 

Ebringerová, A., & Heinze, T. (1999). Naturally occuring xylans structures, isolation procedures and 
properties. Macromolecular Rapid Communications, 21(9). 

Faraco, V. (2013). Lignocellulose Conversion. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. 
https://doi.org/10.1007/978-3-642-37861-4 

Grimm, B., Porra, R. J., Rüdiger, W., & Scheer, H. (2006). Chlorophylls and Bacteriochlorophylls (Vol. 
25, ss. 1-26). Dordrecht: Springer Netherlands. https://doi.org/10.1007/1-4020-4516-6 

Hassid, W. Z. (2014). Polysaccharide. Access Science. https://doi.org/10.1036/1097-8542.536800 

Henriksson, G., & Lennholm, H. (2009). Pulp and Paper Chemistry and Technology Wood Chemistry 
and Wood Biotechnology. Pulp and paper chemistry and technology: Wood chemistry and wood 
biotechnology (Vol. 1, ss. 120). https://doi.org/10.1515/9783110213409 

Himmel, M. E., Ding, S.-Y., Johnson, D. K., Adney, W. S., Nimlos, M. R., Brady, J. W., & Foust, T. D. 
(2007). Biomass Recalcitrance: Engineering Plants and Enzymes for Biofuels Production. Science, 
315(5813). 

Jatinder, K., Chadha, B. S., & Saini, H. S. (2006). Optimization of culture conditions for production of 
cellulases and xylanases by Scytalidium thermophilum using response surface methodology. World 



	 	 	
	

31	
	

Journal of Microbiology and Biotechnology, 22, 169–176. https://doi.org/10.1007/s11274-005-
9015-2 

Kachlishvili, E., Penninckx, M. J., Tsiklauri, N., & Elisashvili, V. (2006). Effect of nitrogen source on 
lignocellulolytic enzyme production by white-rot basidiomycetes under solid-state cultivation. 
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22(4), 391–397. 
https://doi.org/10.1007/s11274-005-9046-8 

Kaur, A. P., Nocek, B. P., Xu, X., Lowden, M. J., Leyva, J. F., Stogios, P. J., Savchenko, A. (2015). 
Functional and structural diversity in GH62 α-L-arabinofuranosidases from the thermophilic fungus 
S cytalidium thermophilum. Microbial Biotechnology, 8(3), 419–433. https://doi.org/10.1111/1751-
7915.12168 

Laghi.I. (2013). Cellulosa [Elektronisk bild]. Hämtad mars 29, 2017 från 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cellulose_strand.svg?uselang=sv  

Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., & Wang, X. (2012). Technology prospecting on enzymes: 
application, marketing and engineering. Computational and structural biotechnology journal, 2(3). 
https://doi.org/10.5936/csbj.201209017 

Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H. (Daniel H., & Stahl, D. A. (2015). Brock 
biology of microorganisms (Uppl. 14, ss. 39). London: Pearson. Retrieved from 
http://chans.lib.chalmers.se/record=b2193998 

McGrane, M. M. (2014). Carbohydrate. Access Science. https://doi.org/10.1036/1097-8542.107910 

McGraw-Hill Education. (2003). McGraw-Hill Dictionary of Science and Technical Terms (Uppl. 6). 
New York. 

McKee, L. S. (2017). Measuring Enzyme Kinetics of Glycoside Hydrolases Using the 3,5-
Dinitrosalicylic Acid Assay. In Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) (Vol. 1588, ss. 27–36). 
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6899-2_3 

Miller, G. L. (1959). Use Of Dinitrosalicylic Acid Reagent For Determination Of Reducing Sugar. 
Analytical Chemistry, 31(3), 426–428. Hämtad från 
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60147a030 

Mäkelä, M. R., & de Vries, R. P. (2014). Plant biomass degradation by fungi. Fungal Genetics and 
Biology, 72, 2–9. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2014.08.010 

Newman, S. (2008). Final energy crisis (Uppl. 1). London: Pluto Press. Hämtad från 
http://ebookcentral.proquest.com/lib/chalmers/reader.action?docID=3386420 

Onipe, O. O., Jideani, A. I. O., & Beswa, D. (2015). Composition and functionality of wheat bran and its 
application in some cereal food products. International Journal of Food Science and Technology, 
50(12), 2509-2518. https://doi.org/10.1111/ijfs.12935 

Pandey, A. (2003). Solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13(2), 81–84. 
https://doi.org/10.1016/S1369-703X(02)00121-3 

Peciulyte, A., Anasontzis, G. E., Karlström, K., Larsson, P. T., & Olsson, L. (2014). Morphology and 
enzyme production of Trichoderma reesei Rut C-30 are affected by the physical and structural 
characteristics of cellulosic substrates. Fungal Genetics and Biology, 72, 64–72. 
https://doi.org/10.1016/j.fgb.2014.07.011 

Percival Zhang, Y.-H., Himmel, M. E., & Mielenz, J. R. (2006). Outlook for cellulase improvement: 
Screening and selection strategies. Biotechnology Advances, 24(5), 452–481. 
https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2006.03.003 

Pińkowska, H., Wolak, P., & Złocińska, A. (2011). Hydrothermal decomposition of xylan as a model 
substance for plant biomass waste – Hydrothermolysis in subcritical water. Biomass and Bioenergy, 



	 	 	
	

32	
	

35(9), 3902–3912. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2011.06.015 

Sjöström, E. (1993). Chapter 3 – Wood polysaccharides. In Wood Chemistry (ss. 51–70). 
https://doi.org/10.1016/B978-0-08-092589-9.50007-3 

Sørensen, I., & Rose, J. K. C. (2014). Cell walls (plant). Access Science. https://doi.org/10.1036/1097-
8542.117510 

Tao, B. Y. (2014). Biomass. Access Science. https://doi.org/10.1036/1097-8542.083300 

Van Den Brink, J., & De Vries, R. P. (2011). Fungal enzyme sets for plant polysaccharide degradation. 
Applied microbiology and biotechnology, 91(6), 1477-92. https://doi.org/10.1007/s00253-011-
3473-2 

Villarreal, M. R. (2015). Cellväggen hos växter [Elektronisk bild]. Hämtad mars 27, 2017 från 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Plant_cell_wall_diagram_gl.svg  

Wellner, D. (2016). Enzyme. Access Science. https://doi.org/10.1036/1097-8542.236000 

Whistler, R. L., & Daniel, J. R. (2014). Pectin. Access Science. https://doi.org/10.1036/1097-
8542.493700 

Wiegant, W. M. (1992). Growth characteristics of the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum in 
relation to production of mushroom compost. Applied and Environmental Microbiology, 58(4), 
1302-1307  

Yikrazuul. (2009). Xylan [Elektronisk bild]. Hämtad mars 30, 2017, från 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Xylan.svg 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  



	 	 	
	

33	
	

Bilaga 1 
Standardkurvor  

 

Figur 20. Standardkurva för Bradfordanalys, med BSA koncentrationerna 50, 75, 125, 250, 500 och 750 µg/ml. 
Genom en trendlinje genom samtliga punkter fås ett samband mellan absorbans och koncentrationen av BSA. 
Ekvationen för trendlinjen ses i grafen. 

  
Figur 21. Standardkurva för pNP-analys med fritt pNP i koncentrationerna 0, 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05, 0,075, 
0,1 och 0,15 mmol/l. Genom en trendlinje genom samtliga punkter fås ett samband mellan absorbans och 
koncentration av fritt pNP. Ekvationen för trendlinjen ses i grafen. 

 



	 	 	
	

34	
	

 
Figur 22. Standardkurva för DNSA-analys med glukos i koncentrationerna 0, 0,05, 0,1, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2 och 2,5 
mg/ml. Genom en trendlinje genom samtliga punkter fås ett samband mellan absorbans och koncentration av 
reducerande ändar. Anledningen varför glukos användes, var för att den bara kan reduceras en gång. Ekvationen för 
trendlinjen ses i grafen. 

 

 
 

 

  



	 	 	
	

35	
	

Bilaga 2  
Resultat övernattsmätningar  

 

Figur 23. Övernattsdata av andra omgången av pNP-analyser, vilket ger svar om vilka syntetiska substrat som 
användes till senare steg av översiktsstudien.  



	 	 	
	

36	
	

 

Figur 24. Övernattsdata av andra omgången av DNSA-analyser, vilket ger svar om vilka enzymsubstrat som 
användes till senare steg av översiktsstudien.