text text text text text text Extraktion och kemisk modifiering av hemicellulosa Britta Claesson Jacob Sjöstrand Dahlberg Jakob Obermüller David Sundberg Lisa Sirén Gustafsson Alexander Sörensen Chalmers Tekniska Högskola Institutionen för Kemi- och Bioteknik Handledare: Gunnar Westman Göteborg, Sverige Kandidatarbete 19 maj 2014 Tillkännagivelser Vi vill tacka v̊ar handledare Gunnar Westman som har hjälpt oss med mentorskap och kon- takter. Vi vill ocks̊a tacka doktoranderna p̊a organisk kemi för deras t̊almodiga assistans i att svara p̊a fr̊agor, l̊asa upp labbet och hämta kemikalier åt oss. Ett stort tack g̊ar ocks̊a ut till företaget Kovalent AB, vars vakuumcentrifug effektiviserade den annars mycket l̊angdragna rullindustningen. Sist men inte minst ett stort tack till Lyckeby Stärkelse AB som har försett oss med startmaterial. i Sammanfattning I strävan mot ett h̊allbart samhälle ligger det intresse i att minska beroende av olja och andra fossila r̊avaror för att tillgodose behovet av energi, kemikalier och material. För att uppn̊a detta m̊aste först och främst värdet i att undersöka förnyelsebara r̊avaror uppmärksammas. Ett biomaterial som har uppvisat intressanta egenskaper liknande de hos dagens oljebaserade produkter är hemicellulosa. Syftet med projektet var att utarbeta en extraktionsprocess för hemicellulosa ur en utvald r̊avara samt att modifiera en del av den extraherade hemicellulosan. Under pro- cessen tillämpades en försöksplanering, s̊a kallad faktorial design (23), för att skapa en modell över extraktionen. Tre parametrar i modellen optimerades varav tv̊a visade sig vara signifikanta. Med hjälp av analysmetoderna IR och 1H-NMR p̊avisades det att arabinoxylan extra- herats fr̊an kornskal. Samma metoder visade ocks̊a en viss förekomst av lignin kovalent bundet till arabinoxylan i det extraherade materialet. Med diskussion har det fastställts att närvaro av cellulosa i det erh̊allna materialet kunnat uteslutas. Vidare erhölls utbyten av hemicellulosa mellan 1.35 g och 2.23 g fr̊an ursprungliga 10 g startmaterial. Den lyckade modifieringen av arabinoxylan som utfördes resulterade i ett annorlunda utseende och kemisk struktur. En kemisk modifiering innebär att det är möjligt att ändra fysikaliska egenskaper hos materialet och därmed utöka hemicellulosans använingsomr̊a- den. Abstract In the quest towards a sustainable society it is in everyone’s interest to reduce the dependence on oil and other fossil raw materials. To achieve this first of all attention must be given to the value in exploring renewable substitutes. A biomaterial that has shown interesting properties, similar to those of today’s oil-based products, is hemicellulose. The purpose of the project was to develop a method for extraction of hemicellulose from a selected raw material and to modify a portion of the extracted hemicellulose. The extraction process was performed under the influence of an experimental design, so called factorial design (23), to create a model over the extraction. Three parameters of the model were optimized, two of which proved to be significant. With the use of the analytical methods IR and 1H-NMR, it was detected that ara- binoxylan was successfully extracted from barley husks. With the same methods it was confirmed that some lignin, covalently bound to arabinoxylan, was present in the extracted material. With discussions it has been claimed that the presence of cellulose in the extrac- ted material could be excluded. The extracted hemicellulose resulted in yields between 1.35 g and 2.23 g from initial 10 g starting material. The successfully performed modification of arabinoxylan resulted in a material with different appearance and chemical structure. A chemical modification indicates that it is possible to change physical properties and expand the number of applications for hemi- cellulose. ii Inneh̊all 1 Introduktion 1 1.1 Syfte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Avgränsningar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 Teoretisk bakgrund 2 2.1 Biopolymerer i växter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2.1.1 Cellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2.1.2 Lignin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.1.3 Hemicellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.2 Kornskal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.3 Extraktion av hemicellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2.4 Modifiering av polysackarider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2.5 Försöksplanering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.5.1 23 Faktorial Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.5.2 Effekter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.5.3 Variansanalys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.5.4 Tillägg av central- och axialpunkter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.5.5 Regressionsmodellering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.6 Analysmetoder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.6.1 Infraröd spektroskopi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.6.2 Kärnmagnetisk resonans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3 Materiel 12 4 Metod 12 4.1 Val av r̊avara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 4.2 Extraktion ur malt kornskal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 4.2.1 Försöksplanering för extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 4.2.2 Extraktionsförsök med optimala parametervärden . . . . . . . . . . . . 14 4.3 Modifiering av hemicellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5 Resultat 14 5.1 Torrhaltsbestämning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.2 Extraktion av hemicellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.2.1 Analys av extraktionsprover . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 5.2.2 Regressionsmodellering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 5.2.3 Optimering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 5.3 Modifiering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 6 Diskussion 22 6.1 Karakterisering av extraherat material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 6.1.1 Regressionsmodellering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 6.2 Modifiering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 7 Slutsats 24 8 Litteraturförteckning 24 9 Appendix I A Beräkningar I A.1 Torrviktsbestämning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I A.2 Beräkning av parametervärden vid faktorial- central- och axialpunkter . . . . . I iii B Grafer I B.1 1H-NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I B.2 13C-NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X C MATLAB-algoritm X iv 1 Introduktion Idag tillgodoses v̊ara behov av energi, kemikalier och material till stor del av petroleum och naturgas. Framtida kostnader för att tillverka produkter av dessa fossila r̊avaror kommer att öka i och med att konkurrensen för den återst̊aende oljan och naturgasen blir allt större. Dessutom har efterfr̊agan för mer miljövänliga alternativ tilltagit i och med ökad medvetenhet för miljö- och klimatp̊averkan bland konsumenter och beslutsfattare. Denna utveckling har kraftigt ökat incitamenten för att utveckla ny miljövänlig produktion [1]. För att kunna överg̊a till ett mer h̊allbart samhälle m̊aste människan bland annat ta bätt- re hand om r̊avaror och minska sitt avfall. En global trend som leder denna utveckling är överg̊angen till biobaserade r̊avaror som kan tillgodose v̊ara behov av energi, kemikalier och material p̊a ett nytt och förnyelsebart vis [2]. Med nya tekniker och metoder öppnas möjligheten för fler förnyelsebara r̊avaror att ersät- ta petroleum i bland annat plaster och kompositer. Plastförpackningar är idag det främsta verktyget för att bevara v̊ara livsmedels produktkvalitet och för att förlänga dess h̊allbar- het. Samtidigt är syntetiskt förpackningsavfall problematiskt ur flera avseenden, kanske främst ekologiskt. Av denna anledning undersöks lipider, proteiner och polysackarider intensivt som filmbildande material [3]. Genom att bättre hush̊alla med förnyelsebara r̊avaror i befintliga produktionsflöden skul- le en stor miljövinst kunna uppn̊as. Ett exempel p̊a detta är outnyttjad hemicellulosa som återfinns i stora kvantiteter i flertalet industrier med anknytning till skogs- och lantbruk, till exempel i sulfatmassabruk som idag bryter ner och förbränner hemicellulosa under produktion av pappersmassa [4]. Trots att hemicellulosa utgör 20-30 viktprocent av r̊avarans torrmassa separeras den fr̊an pappersmassan och bränns slutligen upp i processens sodapanna [5]. Hemicellulosa är en av de tre grupper polymeriska best̊andsdelar som förekommer i cellväg- gen hos växter, där de tv̊a andra ämnena är lignin och cellulosa. Hur stor andel av växtmassan som utgörs av hemicellulosa beror p̊a vilken del av växten som analyseras och vilken art den tillhör. Träd best̊ar typiskt av 20-35 viktprocent hemicellulosa [6] medan ett̊ariga växter har visats inneh̊alla s̊a mycket som 46 viktprocent, vilket gör hemicellulosa till en av de vanligast förekommande naturliga polymererna. Extraherad hemicellulosa har en rad potentiella användningsomr̊aden. I sin polymeriska form har hemicellulosa bland annat visat lovande resultat för framtida användning inom pac- ketering [7], läkemedelsfrisättning i tablettform [8] samt hydrogeler, det vill säga superabsor- benter [9]. Dessutom skulle hemicellulosa kunna bearbetas för att ersätta en betydande andel petroleumbaserade drivmedel och organiska baskemikalier [10], [11]. Många försök har gjorts för att extrahera hemicellulosa ur olika r̊avaror med olika metoder och volymer [4], [12], [13], [14]. Ofta p̊averkar extraktionen av hemicellulosa andra produkter som kan extraheras ur samma r̊avara. Särskilt sv̊art är det att extrahera hemicellulosa utan att p̊averka befintliga produkters kvalité och kvantitet. I exempelvis pappersmassabruk skulle en extraktion av hemicellulosa skapa en konflikt mellan pappersmassans kvalité och mängd återvunnen hemicellulosa. Dessa konflikter försv̊arar hemicellulosans utveckling inom befintliga industrier och d̊a särskilt storskaliga s̊adana, som papper- och massaindustrin [11]. För att undvika särintressen har den här studien fokuserat p̊a en r̊avara där extraktionen av hemicellulosa inte kommer i konflikt med andra befintliga intressen för r̊avarans använd- ning. Med detta i åtanke har kornskal, som är en restprodukt fr̊an jordbruk med en hög halt hemicellulosa, använts som r̊avara. 1.1 Syfte Syftet med projektet är att ur vald r̊avara extrahera polymerisk hemicellulosa. En modell ska tas fram som beskriver hur utbytet av hemicellulosa beror av utvalda parametrar i syfte att öka utbytet. En modifiering ska utföras för att förändra hemicellulosans egenskaper och tillämp- ningar. Extraktet ska karakteriseras med lämpliga metoder. Karakteriseringen ska bekräfta att hemicellulosa har extraherats, samt att modifieringen som utförts uppn̊att önskat resultat. 1 1.2 Avgränsningar Valet av startmaterial begränsades till en r̊avara fr̊an lantbruks- eller skogsindustrin för att skapa ett resultat av intresse för svensk industri och forskning. R̊avarans tillgänglighet i Sverige resulterar även i korta transportsträckor och därmed minskad miljöp̊averkan. Försöksdesignen som har använts är en 23 faktorial design. Antalet parametrar till försöks- designen begränsades till tre stycken. Avgränsningen gällande antalet r̊avaror och parametrar var relevant eftersom ytterligare en r̊avara skulle innebära 18 nya experiment. Undersökning av ytterligare parametrar hade även det ökat antalet experiment avsevärt. Hade fler r̊avaror eller parametrar undersökts skulle det inneburit ett betydligt större projekt än vad som hade rymts inom tidsramen. Projektet syftade delvis till att undersöka vilka parametrar som är signifikanta för hemicel- lulosautbytet och utifr̊an detta bygga en regressionsmodell. Dock dras inga slutsatser gällande de kemiska och fysikaliska processer som ligger till grund för parametrarnas effekt. Denna av- gränsning tar sin grund i att hemicellulosans sammansättning skiljer sig åt mellan r̊avaror och att r̊avaran vid projektformuleringen inte var bestämd. Detta tillsammans med att teoretiskt ing̊aende litteratur p̊a omr̊adet är knapphändig gör att åtagandet bedömdes vara för stort. Antalet modifieringar har begränsats till en. För att f̊a en tydligare bild av potentialen hos modifierad hemicellulosa krävs betydligt fler modifieringar och djupare analys av hemicellulo- sans förvärvade egenskaper. Tid och utrustning har dock varit begränsande faktorer. Karakterisering har främst utförts med IR-spektroskopi, 1H-NMR och 13C-NMR. Fler ana- lysmetoder hade gett en bättre först̊aelse för det extraherade materialet, dock har tillgänglighet och tid begränsat karakteriseringen till de ovan nämda metoderna. Polymerstorleken har inte heller kunnat utvärderas d̊a s̊adan utrustning inte varit tillgänglig. Vidare har projektet inte studerat hur en eventuell uppskalning av extraktion samt modi- fiering skulle kunna utföras. 2 Teoretisk bakgrund I följande avsnitt presenteras den teoretiska bakgrund som rapporten bygger p̊a. Inledningsvis beskrivs de polymerer som bygger upp cellväggen hos växter. Vidare presenteras teori tillhö- rande kornskal, extraktion av hemicellulosa samt modifiering av polysackarider, följt av teori bakom försöksplanering samt analysmetoder. 2.1 Biopolymerer i växter Växtceller är inneslutna av en cellvägg best̊aende av olika typer av polymerer. Polymertypernas struktur och mängd kan variera stort beroende p̊a växtart, typ av vävnad, stadie i utvecklingen och vilket vägglager som avses [15]. De vanligaste biopolymererna i växtceller är cellulosa, lignin och hemicellulosa, men det förekommer även andra ämnen s̊a som pektiner, proteiner, fetter samt vatten [16]. Förh̊allandet mellan best̊andsdelarna varierar mellan olika växttyper [17]. Polysackarider är kolhydrater som är allmänt förekommande i växtvärlden där de fyller olika funktioner, främst strukturgivning och energibevaring. P̊a grund av deras funktionsbredd används polysackarider inte bara inom livsmedelsindustrin utan även inom ett flertal andra industrier [18]. 2.1.1 Cellulosa Cellulosa är den vanligast förekommande biopolymeren i växtceller där den utgör ungefär 40% av cellväggens torrvikt. Dess huvudsakliga funktion är att ge växter stabilitet och styvhet [19]. Cellulosa är en väldefinierad grupp polysackarider som endast skiljer sig åt med avseende p̊a polymeriseringsgrad och kristallinitet. Cellulosapolymerer är homogena, vilket innebär att hela polymeren är uppbyggd av likadana monomerer [20]. Polymerkedjorna best̊ar av l̊anga kedjor av D-glukos som är ihopkopplade via β-1,4-bindningar, se Figur 1. Kedjorna kan förekomma 2 helt utsträckta, där varje glukosmolekyl är vinklad 180◦ mot nästa. Detta gör att de kan forma bindningar inom och mellan kedjorna, n̊agot som ger cellulosan dess stabiliserande egenskaper [21]. Cellulosa är olösligt i vatten och flertalet andra polära lösningsmedel p̊a grund av de starkt verkande inter- och intramolekylära interaktionerna inom fibernätverket [18]. Figur 1: Tv̊a sammanlänkade D-glukosmonomerer som utgör den repetativa enheten för cellu- losa. 2.1.2 Lignin Efter cellulosa anses lignin vara den vanligaste förekommande biopolymeren [22]. Andelen lignin i växtmaterial varierar mellan 18-35 viktprocent. I växter fungerar lignin framförallt som mekaniskt stöd genom att nätverk av ligninfibrer binder till cellväggarna och p̊a s̊a vis förankrar cellerna [23]. Lignin best̊ar av korta linjära enheter av fenylpropan som tvärbinds genom länkar av gly- cerolaryleter. Monomererna i lignin ansluts via eter- och C-C-bindningar vilket ger upphov till en komplex tredimensionell struktur [22]. Lignin är en stor biopolymer som huvudsakligen best̊ar av starka ester- och fenylgrupper, vilket gör det sv̊arlösligt i nästan alla lösningsmedel och komplicerar separation fr̊an övriga biopolymerer [24]. 2.1.3 Hemicellulosa Begreppet hemicellulosa myntades under sent 1800-tal för att särskilja en grupp polysackarider fr̊an cellulosa. Initialt antogs dessa vara strukturellt och kemiskt besläktade med cellulosa men det fastslogs senare att hemicellulosa är en grupp polysackarider med en sammansättning, struktur och biosyntes som skiljer sig fr̊an den hos cellulosa [16]. Hemicellulosa är till skillnad fr̊an cellulosa inte ett lika väldefinierat begrepp. Hemicellu- losapolymerer är betydligt kortare än cellulosa och är heterogena, vilket innebär att polymer- kedjorna byggs upp av en kombination av olika monomerer. Hemicellulosa binder till cellulosa med vätebindningar. Dessutom binder hemicellulosa kovalent till lignin genom esterbindningar till acetylenheter och hydroxikanelsyror [20]. Hemicellulosa delas in i fyra övergripande grupper; xylaner, mannaner, ”mixed linkage”- β-glukaner och xyloglukaner. Grupperna skiljer sig åt i vilka typer av sidokedjor de har och hur ofta dessa förekommer p̊a ryggraden. Xylaner är den vanligaste typen av hemicellulosa framförallt i lövträd och ett̊ariga plantor, medan mannaner är vanligast i barrträd. ”Mixed linkage”-β-glukaner förekommer marginellt i sädesslag och xyloglukaner återfinns i kärlväxter [25]. 2.2 Kornskal Korn är ett robust sädesslag som odlas vid olika årstider beroende p̊a klimat. I Sverige odlas den främst p̊a v̊aren men kan i de södra delarna av landet även odlas p̊a hösten [26]. Ungefär 13 viktprocent av kornet utgörs av dess skal, som i sin tur best̊ar av 30 viktprocent hemicellulosa. Skalet saknar näringsvärde för människan [27]. Den huvudsakliga hemicellulosan i kornskal är arabinoxylan, som strukturellt best̊ar av en linjär ryggrad av xylan med monomeriska förgreningar. De individuella sidoförgreningarna 3 best̊ar för det mesta av α-L-arabinofuranos men även 4-O-metyl-α-D-glukuronsyra förekom- mer. Dessa är sammanlänkade med O-glykosidbindningar till polymerens ryggrad, se Figur 2. P̊a ryggraden av xylan förekommer även disackarid- och trisackaridrester best̊aende av 2- O-D-xylopyranosyl-α-L-arabinofuranos, eller sm̊a mängder av andra terminala rester, s̊asom galaktos eller glukos bunden till arabinofuranisylgrupper. Det förekommer även disackarid- och trisackaridrester best̊aende av 2-O-D-xylopyranosyl-α-L-arabinofuranos, eller sm̊a mäng- der av andra terminala rester, s̊asom galaktos eller glukos bundet till arabinofuranosylgrupper p̊a ryggraden av xylan [28]. Figur 2: Struktur över arabinoxylan. Sammanlänkade enheter av xylos utgör ryggraden i po- lymeren och sidoförgreningarna best̊ar för det mesta av enkla arabinosenheter men även glu- kuronsyra förekommer. 2.3 Extraktion av hemicellulosa I relation till de tv̊a andra stora grupperna av biopolymerer innefattas hemicellulosa av en betydande diversitet. Diversiteten i kombination med den historiska bristen p̊a användnings- omr̊aden har lett till bristande kunskap vad gäller separation- och extraktionsmoment. Metoder fr̊an litteraturkällor skiljer sig ocks̊a avsevärt åt beroende p̊a var informationen är hämtad. Kri- terierna för renhet är heller inte likformiga [29]. Vid extraktion av hemicellulosa ur växtceller finns det ett antal komponenter som hemicel- lulosan behöver separeras fr̊an. Dels behöver fetter i cellmembranet lösas upp, n̊agot som kan utföras genom en mild förbehandling med syra [7]. Dessutom behöver lignin avlägsnas. Det finns olika metoder för delignifiering, exempelvis genom behandling med natriumklorit. Natri- umkloriten verkar genom att bryta ned lignin samt bindningar mellan lignin och kolhydrater. Delignifieringen sker ofta vid förhöjda temperaturer d̊a det ökar reaktiviteten hos det deligni- fierande medlet [30]. När fetter och lignin avlägsnats extraheras hemicellulosa lämpligast med basiska medel [7]. Cellulosans kristallstruktur luckras upp och molekylen sväller under alkaliska betingelser [31]. Kovalenta bindningar bryts endast upp i en mindre utsträckning och cellulosan förblir olösligt i vatten, till skillnad fr̊an m̊anga av hemicellulosorna [18]. Cellulosa kan därför avlägsnas fr̊an hemicellulosa genom filtrering. 2.4 Modifiering av polysackarider För att utöka hemicellulosans användningsomr̊aden är det av stor vikt att kunna ändra dess egenskaper genom kemisk modifiering. Katjoniserad hemicellulosa har undersökts som poten- tiell tillsats i pappersmassaindustrin, som flockningsmedel, som jonbytare samtidigt som den har uppvisat antimikrobiella egenskaper [32]. Katjoniserade polysackarider är redan tillgängliga p̊a marknaden, exempelvis katjoniserad stärkelse och cellulosa. Dessa används inom m̊anga industrier s̊asom pappers-, kemikalie-, mat-, kosmetika-, och läkemedelsindustri. Mängden användningsomr̊aden beror p̊a deras unika egen- skaper i kombination med l̊ag kostnad, att de är biologiskt nedbrytbara och att de har l̊ag toxicitet [32]. En vanlig katjoniseringsprocess kan ske genom att polymeren f̊ar reagera med ett katjoniskt reagens under alkaliska betingelser. Detta resulterar i en katjongrupp vid polymerens ryggrad genom företring av hydroxylgrupper [33]. 4 I m̊anga fall används en epoxykemikalie, till exempel 2,3- epoxypropyltrimetylammoniumklorid (EPTMAC). I Figur 3 visas en generell katjonisering med EPTMAC. Tack vare den l̊aga bindningsvinkeln för syre i epoxypropylgruppen är detta ämne reaktivt och lämpar sig för den här typen av modifiering [32]. Figur 3: Schematisk bild över reaktion mellan polysackarid och EPTMAC. 2.5 Försöksplanering Syftet med en försöksplanering är att undersöka hur stor inverkan olika ing̊aende parametrar har p̊a resultatet av ett experiment. Inledningsvis väljs vilka parametrar som skall undersökas, och de tilldelas ett hög- och ett l̊agvärde var. Samma experiment upprepas sedan flera g̊anger, och varje iteration av experimentet har en unik kombination av hög- och l̊agvärden p̊a paramet- rarna. Hur m̊anga g̊anger experimentet m̊aste upprepas beror dels p̊a hur m̊anga parametrar som ska undersökas och dels p̊a vilken typ av försöksdesign som används. När experimenten utförts är det möjligt att fastsl̊a vilka parametrar som har en signifikant effekt, samt att ställa upp en regressionsmodell som beskriver resultatet som en funktion av parametrarna. 2.5.1 23 Faktorial Design Tabell 1: Generell designmatris för 23 Faktorial Design. Försök I A B C Etikett 1 + - - - (1) 2 + + - - a 3 + - + - b 4 + + + - ab 5 + - - + c 6 + + - + ac 7 + - + + bc 8 + + + + abc I försöksdesignen 23 faktorial design utförs åtta grundläggande experiment för att undersöka tre parametrar A, B och C. Upplägget p̊a dessa åtta experiment åsk̊adliggörs schematiskt i Tabell 1. Den första parametern ”I” är ett intercept nödvändigt för att passa in modellen i y- led. I designmatrisen betecknas en parameters högvärde av ”+”, och l̊agvärde av ”-”. Etiketten betecknar vilken parameter som har sitt högvärde i försöket. En enkel regressionsmodell kan utifr̊an denna design ställas upp p̊a formen y = β0 + β1x1 + β2x2 + β3x3 + ε (1) där y representerar mätresultatet, xi representerar den kodade variabeln för parametern i kolonn i i designmatrisen; exempelvis motsvarar x1 här parameter A. Att variabeln är kodad innebär att den skalats till att anta ett l̊agvärde p̊a -1 och ett högvärde p̊a +1. Regressionsko- efficienten βi representerar effekten av variabel xi [34]a. 5 2.5.2 Effekter Den genomsnittliga effekten av en parameter A, B eller C kan beräknas enligt A = 1 4n [a+ ab+ ac+ abc− (1)− b− c− bc] (2) B = 1 4n [b+ ab+ bc+ abc− (1)− a− c− ac] (3) C = 1 4n [c+ ac+ bc+ abc− (1)− a− c− ac] (4) där n betecknar antalet replikationer av designen, a betecknar resultatvärdet av försök a, ab beteckar resultatvärdet av försök ab och s̊a vidare. Effekten A definieras allts̊a som den genomsnittliga skillnaden i resultatvärde mellan de försök där A har ett hög- respektive l̊agvärde. P̊a ett liknande sätt kan eventuella interaktionseffekter beräknas. En interaktion sker d̊a effekten av en faktor beror av värdet p̊a en annan faktor. Interaktionseffekten AB kan s̊aledes definieras som den genomsnittliga skillnaden mellan effekten A vid de tv̊a olika värdena för B. Vidare kan interaktionseffekten ABC definieras som den genomsnittliga skillnaden mellan effekten AB vid de tv̊a olika värdena p̊a C. Det är möjligt att utöka designmatrisen i Tabell 1 s̊a att den innefattar interaktionseffekter, vilket kan ses i Tabell 2. Tabell 2: Designmatris med interaktionseffekter. I A B AB C AC BC ABC (1) + - - + - + + - a + + - - - - + + b + - + - - + - + ab + + + + - - - - c + - - + + - - + ac + + - - + + - - bc + - + - + - + - abc + + + + + + + + Notera att tecknen för en interaktionseffekts kolonn beräknas som produkten av tecknen hos dess ing̊aende huvudeffekter. Det är nu möjligt att ställa upp en regressionsmodell som tar hänsyn även till interaktions- effekterna enligt Ekvation 5 [34]a. y = β0 + β1x1 + β2x2 + β12x1x2 + β3x3 + β13x1x3 + β23x2x3 + β123x1x2x3 + ε (5) 2.5.3 Variansanalys För att kunna ställa upp en modell som kan förutse resultatvärden m̊aste först de effekter som faktiskt har en signifikant verkan identifieras. Detta görs med en variansanalys. Den totala variansen i en försöksserie beräknas med kvadratsumman över resultatvärdena enligt Ekvation 6 SST = ∑ i (yi − ȳ)2 (6) där ȳ är det sammanlagda genomsnittet för y [34]b. För att beräkna variansen som de olika effekterna bidrar med behöver deras kontraster beräknas. I Ekvation 2, 3 och 4 kan kontrasterna ses som kvantiteterna inom hakparanteserna, och kontrasterna för interaktionseffekterna kan beräknas p̊a samma sätt utifr̊an Tabell 2. Effekternas kvadratsummor beräknas enligt Ekvation 7, och s̊aledes kan den generella ekvationen, 8, ställas upp, där den sista termen SSE st̊ar för kvadratsumman av residualen. 6 SS = (Kontrast)2 8n (7) SST = SSA + SSB + SSAB + SSC + SSAC + SSBC + SSABC + SSE (8) En översk̊adlig ANOVA-tabell (se Tabell 3) kan nu ställas upp för variansanalysen. ANOVA st̊ar för analysis of variance [34]c. Mean square (MS) beräknas som kvadratsumman för ett element dividerat med dess frihetsgrader, och genom att jämföra MS för en effekt med MSE (mean square för residualen) f̊as effektens variansbidrag relativt den naturliga variansen. Det resulterande F0-värdet jämförs med ett tabellvärde Fα,v1,v2 , där α betecknar signifikansgraden, 0 < α < 1, v1 representerar antal frihetsgrader hos täljaren och v2 är antal frihetsgrader hos nämnaren. Tabell 3: ANOVA-tabell. Källa Kvadratsumma Frihetsgrader Mean Sqare F0 A SSA 1 MSA MSA/MSE B SSB 1 MSB MSB/MSE C SSC 1 MSC MSC/MSE AB SSAB 1 MSAB MSAB/MSE AC SSAC 1 MSAC MSAC/MSE BC SSBC 1 MSBC MSBC/MSE ABC SSABC 1 MSABC MSABC/MSE Error SSE 2k(n− 1) MSE Total SST n2k − 1 Ett hypotestest för varje modell kan nu formuleras enligt H0 : β1 = β2 = · · · = β123 = 0 (9) H1 : β 6= 0 för minst ett β (10) H0 förkastas i det fall där F0 > Fα,v1,v2 , och effekten inkluderas i regressionsmodellen. I de fall d̊a F0 < Fα,v1,v2 kan inte H0 med säkerhet förkastas, vilket är likvärdigt med att ingen effekt kan observeras, och dessa utesluts ur modellen [34]a,b. 2.5.4 Tillägg av central- och axialpunkter Regressionsmodellen som tas fram i Ekvation 5 kan inte beskriva ett förlopp som ökar kvadra- tiskt med n̊agon variabel. En generell s̊adan modell för ett s̊adant förlopp som beror av tre parametrar beskrivs i Ekvation 11. y = β0 + 3∑ i=1 βixi + j=3∑∑ i Fα,1,nC−1 och s̊aledes konstatera att kvadratiska effekter m̊aste tas i åtanke. En problematik uppst̊ar vid formuleringen av en regressionsmodell med samtliga huvud-, interaktions- och kvadratiska effekter likt den som beskrivs i Ekvation 11, efter 8 faktorial- och nC centralpunktsmätningar. Modellen best̊ar av 11 odefinierade parametrar, men antalet unika experimentpunkter uppg̊ar endast till 9. Det är i detta läge möjligt att utöka designen med 6 axialpunkter, placerade s̊a att de kodade variablerna befinner sig vid avst̊and √ 3 och − √ 3 fr̊an centralpunkterna. En schematisk tabell över de kodade parametervärdena för parameter A, B och C i en design med 8 faktorialpunkter, 4 centralpunkter och 6 axialpunkter redovisas i Tabell 4 [34]d. Tabell 4: Schematisk tabell för design med faktorial- central- och axialpunkter. Experiment A B C 1 -1 -1 -1 2 1 -1 -1 3 -1 1 -1 4 1 1 -1 5 -1 -1 1 6 1 -1 1 7 -1 1 1 8 1 1 1 9 0 0 0 10 0 0 0 11 0 0 0 12 0 0 0 13 √ 3 0 0 14 − √ 3 0 0 15 0 √ 3 0 16 0 − √ 3 0 17 0 0 √ 3 18 0 0 − √ 3 8 2.5.5 Regressionsmodellering Det är möjligt att skriva om den regressionsmodell som presenterades i Ekvation 11 p̊a linjär form. Ett godtyckligt exempel p̊a hur en s̊adan omskrivning sker visas nedan y = β0 + β1x1 + β2x2 + β12x1x2 + β11x 2 1 + β22x 2 2 + ε = β0 + β1x1 + β2x2 + β3x3 + β4x4 + β5x5 + ε (16) där β3 = β12, x3 = x1x2 och s̊a vidare. Denna omskrivning gör det möjligt att ställa upp uttrycket y = Xβ + ε (17) där: y =  y1 y2 ... yn  ,X =  1 x1,1 · · · x1,k 1 x2,2 · · · x2,k ... ... . . . ... 1 xn,2 · · · xn,k  ,β =  β1 β2 ... βn  , ε =  ε1 ε2 ... εn  Notera här att X baseras p̊a den designmatris som valts (jämför med Tabell 2), och att yi är mätvärdet för parametervärden xi,1, xi,2, . . . , xi,k. Det är möjligt att skatta p̊a β enligt β̂ = (X′X)−1X ′y (18) och därmed bygga en regressionsmodell enligt: ŷ = Xβ̂ (19) En variansanalys p̊a regressionsmodellen och dess ing̊aende komponenter beräknas p̊a ett liknande sätt som i kapitel 2.5.3, där skillnaden är att kvadratsummorna beräknas med linjär algebra. Ett uttryck för SSE kan ställas upp som SSE = y′y − β̂′X ′y (20) vilket härleds ur att residualen för regressionsmodellen ges av e = y − ŷ (21) SST kan skrivas som: SST = y′y − ( n∑ i=1 yi )2 n (22) SSR, det vill säga kvadratsumman av residualen, kan ställas upp enligt SSE = SST − SSR SSR = SST − SSE (23) och en ANOVA-tabell kan ställas upp enligt Tabell 5 där k betecknar antalet β borträknat β0. Genom att testa F0 mot Fα,k,n−k−1 beräknas hypoteserna H0 : β1 = β2 = · · · = βk = 0 (24) H1 : βj 6= 0 för åtminstone ett j (25) 9 Tabell 5: ANOVA-tabell för regressionen. Källa Kvadratsumma Frihetsgrader Mean Square F0 Regression SSR k MSR MSR/MSE Error SSE n− k − 1 MSE Total SST n− 1 Hypotestester p̊a enskilda regressionskoefficienter är nödvändiga för att kunna utesluta de parametrar som är insignifikanta. De hypoteser som ska testas är d̊a H0 : βj = 0 (26) H1 : βj 6= 0 (27) I det fall H0 inte kan förkastas utesluts parameter xj ur modellen. Teststatistikan som används är t0 = β̂j√ ˆσ2Cjj (28) där en skattning av standardavvikelsen, betecknad σ̂2, beräknas enligt σ̂2 = SSE n− p (29) där p = k+ 1. Cjj i Ekvation 28 är diagonalelementet i (X ′X)−1 som korresponderar mot β̂j . Vi kan förkasta nollhypotesen i Ekvation 27 i det fall |t0| > tα/2,n−k−1. Ett m̊att p̊a hur bra modellen passar, R2 adj , kan beräknas enligt R2 adj = 1− SSE/(n− p) SST /(n− 1) (30) där 0 < R2 adj < 1 [34]e. 2.6 Analysmetoder Tv̊a vanliga analysmetoder inom biopolymerisk analys är infraröd (IR) spektroskopi samt kärn- magnetisk resonans, p̊a engelska ”Nuclear Magnetic Resonance” (NMR), som används för att karakterisera och identifiera molekylär sammansättning. IR används främst för att identifie- ra funktionella grupper medan NMR ger information om kolväteskelett när det kommer till uppbyggnad och struktur. 2.6.1 Infraröd spektroskopi IR är en analysmetod som används för att identifiera olika typer av funktionella grupper i organiska material. I denna metod utnyttjas det faktum att olika bindningar mellan atomer har olika vibrationsfrekvens. Infraröd str̊alning har en v̊aglängd p̊a runt 1000 nm vilket motsvarar ca 3× 1014 Hz vilket är ungefär samma frekvens vid vilken molekyler vibrerar. Frekvensen i en bindning är beroende av massan hos molekylens atomer samt bindningens styvhet. En molekyl med lätta atomer och en stel bindning har en högre vibrationsfrekvens och absorbans sker därför vid en högre energi än hos en molekyl med tyngre atomer och mindre stela bindningar. D̊a en infraröd str̊ale passerar genom provet och str̊alens frekvens överensstämmer med frekvensen hos en viss bindning absorberas energi. I detta skede minskar intensiteten av str̊alningen som n̊ar detektorn, vilket avbildas p̊a ett IR- spektrum. P̊a detta vis kan kovalenta bindningar och funktionella grupper i ett ämne identifieras. Det är dock sv̊art att säga n̊agot om ett ämnes 10 molekylstruktur med denna analysmetod och ofta kompletteras IR-spektroskopi med NMR för att identifiera molekylstrukturer [35]a, [36]a. N̊agra av de karakteristiska bindningar och funktionella grupper som förväntas ge utslag i ett IR-spektrum av arabinoxylan visas i Tabell 6, medan n̊agra av de funktionella grupper som skiljer lignin fr̊an övriga ämnen visas i Tabell 7. Cellulosa förväntas ge utslag vid samma frekvenser som arabinoxylan, n̊agot som försv̊arar särskiljande av polymererna med enbart ett IR-spektrum. Tabell 6: V̊agtal till n̊agra av de bindningar och funktionella grupper som återfinns i arabinox- ylan [37], [38]a. Omr̊ade cm−1 Bindning Intensitet Föreningar i arabinoxylan 3600-3100 O-H Medium Koordinerat vatten 3550-3500 O-H Medium Fri OH, karboxylsyror (l̊ag koncentration) 3550-3450 O-H Varierande och skarp Intermolekylärt bundna OH (dimer) 3400-3225 O-H Stark och bred Intermolykylärt bundna OH (polymerisk) 3000-2815 C-H Svag till stark Olika kolvätebindningar 1720-1700 C=O Stark Karboxylsyror 1440-1395 C-O Svag Karbyxylsyror 1240-1070 C-O-C Svag C-O Etrar 1200-1000 C-OH Svag Alkoholer Tabell 7: V̊agtal till n̊agra av de bindningar och funktionella grupper som återfinns i lignin [37], [38]a. Omr̊ade cm−1 Binding Intensitet Föreningar i lignin 3100-3000 C-H Svag till medium CH i aromater 2835-2815 C-H Stark CH i metylethers (O-CH3) 1625-1585 C=C Stark till medium Aromatiska/konjugerade bindningar i bensen 720-600 O-H Svag Fenoler 2.6.2 Kärnmagnetisk resonans NMR är en analysmetod som används för att f̊a information om molekylens struktur, det vill säga kol-väte-uppbyggnaden och dess skelett. Tekniken kan användas för alla atomslag som uppvisar kärnmagnetisk resonans. Karakteristiskt för dessa typer av atomkärnor är ett ojämnt antal neuroner och/eller ett ojämnt antal protoner. Beroende p̊a elektrondensiteten runt atomkärnor f̊ar de spinn med olika frekvenser d̊a de utsätts för ett starkt magnetfält. I ett NMR-spektrum visas signalerna fr̊an dessa frekvenser som toppar. Vidare kan atomer ha flera olika spintillst̊and. Vätekärnan, som endast har tv̊a spinntillst̊and, är enklast att beskriva. När kärnan utsätts för ett starkt magnetfält kommer dessa tv̊a spinn att ordna sig antingen parallellt till fältet eller anti-parallellt. Detta kommer att ge upphov till tv̊a energiniv̊aer som vidare resulterar i att spektrumets toppar splittras beroende p̊a hur m̊anga väten som sitter p̊a närliggande atomer. Sm̊a molekyler som inte inneh̊aller flera typer av vätekonfigurationer ger ett s̊adant utslag i spektrumet att topparna ofta är välseparerade och relativt enkla att tolka. För biopolymerer däremot finns det m̊anga väten i molekylen som ger näst intill identiska utslag p̊a grund av identisk konfiguration. Följden blir ett spektrum med m̊anga överlappande signaler och komplikationer vid fastställandet av polymerens exakta struktur. Vanligtvis kan det endast konstateras att den inneh̊aller eller saknar olika typer av molekylfragment, vilket i hemicellulosans fall skulle vara olika kolhydrater [35]b. I ett 1H-NMR-spektrum visas toppar för arabinoxylan vid 5.2-5.4 ppm och för xyloser vid 4.4-4.7 ppm [39]. Vid 4.5 ppm och vid 5.2 ppm g̊ar det även att återfinna glukostoppar, det vill säga cellulosa-fragment [40]. Slutligen visar sig aromatringar vid 7 ppm, n̊agot som är utmärkande för lignin [36]b. 11 För att f̊a mer detaljerad information gällande struktur kan HSQC-NMR tillämpas. HSQC- NMR ger ett 2D-spektrum där 1H- och 13C-NMR korrelerar [38]b. Vid katjonisering av poly- sackarider g̊ar det att tyda att kovalent bunden EPTMAC ger en signal i ett HSQC-spektrum vid (3.1;85) ppm [40]. 3 Materiel Hemicellulosa extraherades ur kornskal som levererades i mald form fr̊an företaget Lyckeby Culinar AB, Kristianstad. Torrhalten bestämdes med hjälp av en IR-ugn, IR-35 Denver In- struments, vid 160 ◦C. IR-analys genomfördes med Perkin Elmer Spectrum One instrument med frekvenser mellan 500-4000 cm−1. Tabletterna till IR-analysen pressades med 0.3 g kali- umbromid och 0.002 g av materialet som skulle analyseras. NMR utfördes p̊a ett Varian 400 System med frekvenserna 400 MHz för protondetektion och 100 MHz för koldetektion. 1H- NMR genomfördes med ett frekvensomf̊ang p̊a 6410 Hz (16ppm), pulsvinkel 45◦, temperatur 25 ◦C och med åtta genomförda pulser per prov. Som referenspunkt sattes vattensignalen till 4.8 ppm. 13C-NMR genomfördes med ett frekvenomf̊ang p̊a 25000 Hz (250 ppm), pulsvinkel 45◦, temperatur 25 ◦C och med 1024 pulser per prov. Samtliga centrifugeringar under extraktionsprocessen utfördes med Thermo Scientific Hera- eus Megafuge 40. Skakbadet som använts är en OLS200, Grant. En viraduk av nylonfiber med porstorlek 5 µm användes vid filtrering av proverna. Dialysslangar som använts var Spectra/Por 2 membrane, MWCO: 12-14,000, spectrum laboratoris inc. Vakuumcentrifugeringen utfördes med The Genevac RocketTM Evaporation System. Kemikalier som har använts genomg̊aende utgörs av 12.1 M saltsyra fr̊an Sigma Aldrich som späddes till 0.05 M, 98% natriumhydroxid fr̊an Eka Nobel som späddes till 4 M och 1 M, natriumborhydrid (NaBH4) fr̊an Sigma Aldrich, 80% natriumklorit fr̊an Sigma Aldrich och 100% ättiksyra fr̊an Sigma Aldrich. Vid modifieringen användes EPTMAC fr̊an Fluka. 4 Metod Följande avsnitt beskriver inledningsvis hur r̊avara valts ut. Vidare presenteras metod för extraktion, där även försöksplaneringens upplägg beskrivs närmare. Avslutningsvis beskrivs hur modifieringen utförts. 4.1 Val av r̊avara Vid val av r̊avara betraktades aspekter som tillgänglighet, miljöp̊averkan och nyttogörande. Efter omfattande litteraturstudier valdes kornskal vilket är en restprodukt fr̊an jordbruksindu- strin. Kornskal har idag f̊a användningsomr̊aden och att använda det för storskalig framtagning av hemicellulosa riskerar inte att konkurrera med andra industrier. Exempelvis riskeras inte delar av livsmedelsindustin att utkonkurreras, d̊a kornskal inte innehar n̊agot näringsvärde för människan. Utöver detta är kornskal en lokal restprodukt, vilket minimerar transportsträckor vid en eventuell industriell uppskalning av extraktionen. 4.2 Extraktion ur malt kornskal Metoden för extraktionen är baserad p̊a en artikel av Höije.A et al. [7], där anpassningar gjorts till befintlig utrustning samt den utformade försöksplanen. En schematisk bild över extraktionen kan ses i Figur 4. 10 g malt kornskal á 18 satser vägdes upp i rundkolvar och 100 ml 0,05 M HCl tillsattes till vardera rundkolv. Proverna fick st̊a förslutna p̊a omrörning under 16 timmar. Därefter centrifugerades proverna under 15 minuter, 4300 rpm. Fiberpelleten sparades och tvättades med 500 ml avjonat vatten genom en viraduk med hjälp av vakuumfiltrering. De tvättade fibrerna löstes sedan i 100 ml avjonat vatten. pH kontrollerades i vardera prov, varp̊a det titrerades till ett p̊a förhand bestämt värde (se Tabell 8) med hjälp av ättiksyra och NaOH. 12 När pH justerats tillsattes NaClO2 (se Tabell 8) och kolvarna sattes p̊a värmeplatta under omrörning med en given temperatur (se Tabell 8). Efter tv̊a timmar fick proverna svalna till rumstemperatur. Därefter centrifugerades proverna var för sig, fiberpelleten sparades och tvättades med 500 ml avjonat vatten p̊a samma sätt som efter den föreg̊aende centrifugeringen. En lösning med 99.5 massprocent 1 M NaOH och 0.5 massprocent NaBH4 förbereddes. Vid varje enskilt försök tillsattes sedan 100 ml av denna lösning till fibrerna. Proverna sattes i ett rumstempererat skakbad under 16 timmar och titrerades därefter till pH 7 med hjälp av 12.1 M HCl och 4 M NaOH. De neutraliserade proverna sattes p̊a dialys till dess att en jämviktskonduktivitet p̊a 12-20 µS m−1 uppn̊atts. Produkten efter dialys tvättades ytligt med 50 ml avjonat vatten genom en viraduk och genomflödet indunstades med hjälp av en vakuumcentrifug. Det torkade materialet vägdes och utbytet beräknades. Figur 4: Schematisk bild över extraktionsmetoden. 4.2.1 Försöksplanering för extraktion De tre parametrar som valts att variera i extraktionsprotokollet var pH-värde i steg 2, mängd natriumklorit i steg 3a samt temperatur i steg 3b (se Figur 4). 18 extraktionsförsök utfördes. Tabell 8 beskriver vilka värden de variabla parametrarna hade vid varje försök samt ordningen i vilken de utfördes. Tabell 8: Experimentella värden för försöksplaneringsparametrarna. Experiment pH m NaClO2(g) T(◦C) 1 4.5 2.60 82.0 2 3.5 2.60 82.0 3 4.5 1.80 82.0 4 3.5 1.80 82.0 5 4.5 2.60 68.0 6 3.5 2.60 68.0 7 4.5 1.80 68.0 8 3.5 1.80 68.0 9 4.0 2.20 75.0 10 4.0 2.20 75.0 11 4.0 2.20 75.0 12 4.0 2.20 75.0 13 4.9 2.20 75.0 14 3.1 2.20 75.0 15 4.0 2.89 75.0 16 4.0 1.51 75.0 17 4.0 2.20 87.1 18 4.0 2.20 62.9 När samtliga prover var färdiga användes mätvärdena för att ställa upp en regressions- modell i MATLAB. Algoritmen som användes finns tillgänglig i Appendix C. Huvudeffekter, interaktionseffekter och kvadratiska effekter beräknades. Genom att eliminera de effekter som inte uppvisat signifikans kunde en regressionsmodell ställas upp. 13 4.2.2 Extraktionsförsök med optimala parametervärden Efter fastställandet av optimala parametervärden utfördes fem extraktioner baserade p̊a dessa, där pH-värdet i steg 2 i Figur 4 sattes till 3.1 och mängd NaClO2 i steg 3a i Figur 4 sattes till 3.02 g. Dessa prover utgick fr̊an 20 g v̊atvikt malt kornskal vardera och utfördes enligt ordinarie extraktionsprotokoll med övriga kemikalievolymer fördubblade. Industning av proverna skedde med hjälp av rullindunstning följt av ugnstorkning i 80 ◦C under 16 timmar. 4.3 Modifiering av hemicellulosa Modifieringen utgick fr̊an ett protokoll framtaget av Bigand V. et al. [33]. Hemicellulosa fr̊an prov 4, 6, 8, 14 och 18 (se Tabell 8) löstes i avjonat vatten till en koncentration p̊a 45.5 g l−1. 44 ml av lösningen värmdes under 20 minuter, 41 ◦C. 10 ml 1.66 M NaOH adderades och lös- ningen sattes p̊a omrörning vid 41 ◦C under ytterligare 20 minuter. Därefter adderades 9.85 g EPTMAC och lösningen fick st̊a under r̊adande förh̊allanden i fem timmar till. Lösningen fick svalna till rumstemperatur, varp̊a dess pH titrerades till 5 med HCl. 150 ml etanol tillsattes sedan droppvis för att fälla ut den modifierade hemicellulosan. Lösningen filtrerades och tvättades med etanol, filterkakan torkades i ugn under 24 timmar, 80◦C. 5 Resultat I följande avsnitt presenteras resultat fr̊an torrhaltsbestämning, extraktion och modifiering samt resultat fr̊an IR- och NMR-analyser. 5.1 Torrhaltsbestämning I de 18 försök som ingick i försöksplaneringen extraherades hemicellulosa fr̊an 10 g malt korn- skal. Torrvikten p̊a startmaterialet för varje s̊adant försök beräknades till 8.813 g utifr̊an den genomsnittliga torrhalten som bestämdes till 88.13 massprocent. 5.2 Extraktion av hemicellulosa Tabell 9 presenterar den erh̊allna massan för samtliga prover förutom prov 12, d̊a inget be- räknat utbyte kunnat erh̊allas fr̊an detta. Massan presenteras som den totala massan efter vakuumcentrifugeringen angiven i gram. Utbytet som anges i tabellen ges av kvoten mellan det extraherade materialets massa och den ursprungliga torrviktsmassan. 14 Tabell 9: Resultat fr̊an försöksplaneringsprov. Experiment Extraherad hemicellulosa (g) Utbyte (%) 1 1.79 20.3 2 1.80 20.4 3 2.09 23.7 4 1.60 18.2 5 2.04 23.1 6 1.75 19.9 7 1.82 20.7 8 1.70 19.3 9 1.68 19.1 10 1.58 17.9 11 1.50 17.0 12 N/A N/A 13 1.35 15.3 14 2.14 24.3 15 1.75 19.9 16 2.23 25.3 17 1.50 17.0 18 1.80 20.4 Genomsnitt 1.77 20.1 Ur samtliga avslutade extraktionsförsök erhölls ett filmbildande material med plastliknande egenskaper, se Figur 5. Färgen p̊a materialet varierade mellan en ljust gul nyans och en mörkare brun nyans, se Figur 6. Samtliga prover var lösliga i vatten. Figur 5: Extraherad och torkat material med filmbildande egenskaper. Figur 6: Skillnad i nyans mellan extraherade prover som är lösta i deuteriumoxid innan analys med 1H-NMR. 15 5.2.1 Analys av extraktionsprover I Figur 7 visas en graf över samtliga provers normerade IR-spektrum. De är normerade genom att transmittansvärdena för varje prov delats med det högsta transmittansvärdet i mätserien. Samtliga prover i försöksserien har toppar vid samma v̊agtal, och följer en tydlig trend. Samtliga IR-spektrum visar en bred topp vid omr̊adet 3000-3500 cm−1 n̊agot som indikerar en blandning av O-H bindningar samt koordinerat vatten. En mindre bred topp mellan v̊agtalet 2925-2850 cm−1 tyder p̊a olika C-H bindningar i materialet. En stark topp vid 1630 liknar bäst de utlsag som konjugerade C-C-bindningar i bensenringar uppvisar. Den utbredda toppen vid 1000-1200 cm−1 talar för C-O bindningar som alkoholer och etrar ger utslag till (se Tabeller 6 och 7). I Figur 8 visas ett NMR-spektrum fr̊an prov 4. D̊a samtliga NMR-spekra visar samma toppar exemplifieras ett utvalt spektrum, varav spektrumen fr̊an prov 1-3 och 5-18 exkluderat 12 visas under bilaga B.1. I spektrumet g̊ar det att urskilja en tydlig topp vid 4.6-4.8 ppm. Dessa toppar visar ändgrupperna p̊a xylan. Tv̊a toppar vid 5.2-5.4 ppm visar p̊a att provet inneh̊aller arabinoxylan. D̊a ingen synlig topp erh̊allits vid 7 ppm tyder detta p̊a att det ej finns lignin i provet. Figur 7: Normerade IR-spektrum för samtliga prover i försöksplaneringen. 16 Figur 8: NMR-spektrum över extraherad hemicellulosa fr̊an prov 4. 5.2.2 Regressionsmodellering Mängden extraherad material (se Tabell 9) användes tillsammans med parametervärderna i Tabell 8 för att erh̊alla följande modell: mHemicellulosa = 6.96305− 0.3226pH − 3.45675mNaClO2 + 0.745m2 NaClO2 (31) Ekvation 31 beskriver det signifikanta sambandet mellan parametervärden och utbyte. Be- räkningarna i Ekvation 32 visar att parametervärdena har en signifikansgrad p̊a 95%, och Ekvation 34 visar att modellen är signifikant till 99%. |t0| − t0.95,13 : β0 = 32.8253 (32) β1 = 2.2853 β2 = 0.0277 β22 = 1.2771 R2 = 0.6903 R2 adj = 0.6189 (33) F0(modell)− F0.99,3,13 = 3.9202 (34) Temperaturen visade sig vara insignifikant vilket kan styrkas om parametern återinförs i MATLAB-koden i Appendix C. Statistiska testresultat redovisas i Ekvation 32, 33 och 34. Sta- tistiska beräkningar samt regressionsmodellering gjordes i MATLAB, algoritmen som användes finns tillgänglig i Appendix C. I Figur 9 visualiseras Ekvation 31 som en konturgraf. Utbytet material n̊ar ett maximalt värde vid pH 3.1 och 1.5 g NaClO2. I Figur 10 visas samma funktion som en tredimensionell 17 yta där kvadratiska effekter av NaClO2 syns tydligt. Figuren redogör ocks̊a för resultaten efter de 18 utförda extraktionsförsöken. Värden p̊a pH och mängden NaClO2 för samtliga punkter visas i Tabell 8. Mängd extraherat material för varje punkt redovisas i Tabell 9. Figur 9: Konturgraf över den ej kodade regressionsmodellen. Ytan beskrivs av Ekvation 31. ”Natriumklorit” åsyftar dess massa i gram och ”Hemicellulosa” syftar p̊a extraherat material i gram. 18 Figur 10: Regressionsyta med extraktionsresultat. Ytan beskrivs av Ekvation 31 och extrak- tionsresultaten visas individuellt som bl̊a cirklar. ”Natriumklorit” åsyftar dess massa i gram och ”Hemicellulosa” åsyftar extraherat material i gram. 5.2.3 Optimering Tabell 10 visar massan extraherat material fr̊an de prover som ämnade att verifiera model- len. Det teoretiska maximala värdet enligt modellen var 4.87 g per 20 g startmaterial. Det genomsnittliga värdet uppn̊adde 86% av det förväntade värdet. Torrvikten för samtliga opti- mumprover var 17.63 g. Utbytet som anges i tabellen är kvoten mellan materialets massa och torrviktsmassa p̊a proverna. Resultaten för Opt1 och Opt2 förkastades d̊a de bedömdes inte vara tillförlitliga. Tabell 10: Resultat fr̊an optimeringstest. Prov Extraherad hemicellulosa (g) Utbyte (%) Opt1 N/A N/A Opt2 N/A N/A Opt3 3.93 22.3 Opt4 3.98 22.6 Opt5 4.64 26.3 Genomsnitt 4.18 23.7 5.3 Modifiering Vid modifieringen erhölls ett ljust pulveraktigt material som till skillnad fr̊an ursprungsmate- rialet inte var filmbildande (se Figur 11). NMR-spektrum för materialet visas i Figur 12. Precis som i de omodifierade proverna syns tydliga toppar vid 4.6-4.8 ppm vilket tyder p̊a att provet inneh̊aller xyloser. De tv̊a mindre topparna runt 5-5.4 ppm indikerar särskilt förekomsten av 19 arabinoxylan. Ett utslag som ej finns i n̊agot av de omodifierade provernas NMR-spektrum är den topp som är synlig vid 3.2 ppm. Figur 11: Det icke filmbildande modifierade materialet. I Figur 13 visas ett normerat IR-spektrum över det modifierade provet samt de enskilda omodifierade proverna innan de blandades och modifierades. Här g̊ar det ej att urskilja n̊agra större skillnader i topparna före gentemot efter modifieringen skett. HSQC-NMR-spektrumet i Figur 14 visar en topp vid (3.1; 85) som p̊avisar att det finns kovalent bundet EPTMAC. Det utfördes även en analys med 13C-NMR, men det gick inte att urskilja n̊agot av värde ur den (se Figur 31 i Appendix B.2). 20 Sample Name: hemi_EPTMAC Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: hemi_EPTMAC_20140512_01 FidFile: hemi_EPTMAC_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 12 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #68, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 3 0 . 0 8 0 . 0 7 0 . 0 4 0 . 1 6 0 . 3 3 0 . 3 0 0 . 0 4 - 0 . 1 0 4 6 . 9 5 5 . 4 0 0 . 6 5 0 . 8 0 4 3 . 2 5 0 . 3 8 0 . 2 9 0 . 1 4 0 . 1 5 0 . 2 7 0 . 7 5 ppm02468101214 Plotname: hemi_EPTMAC_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 12: NMR-spektrum över modifierat arabinoxylan. Figur 13: Normerat IR-spektrum för modifierat arabinoxylan och ursprungsprover. 21 Figur 14: HSQC-spektrum över modifierad hemicellulosa, där pilen markerar den relevanta toppen. 6 Diskussion I följande avsnitt diskuteras resultaten som presenterats under avsnitt 5. 6.1 Karakterisering av extraherat material Hemicellulosor är heterogena polymerer med varierande längd och m̊anga förgreningar, vilket kan komma att p̊averkas av extraktionsförh̊allanden. Trots detta g̊ar det att ur IR-spektrumet i Figur 7 urskilja en tydlig trend mellan de 18 försöken vilket visar att samtliga prover har liknande sammansättning. Den varierande transmittansen som skiljer proverna i grafen kan förklaras av skillnader i homogenitet i de tabletter som skapades till IR-analyserna. Arabinoxylan och cellulosa inneh̊aller olika O-H-bindningar i form av alkoholer vilka för- väntas ge utslag i ett IR-spektrum. Dessa kommer att koordinera vatten runt arabinoxylan och cellulosa. Det koordinerade vattnet tillsammans med OH-grupperna bundna till polymererna kan förklara de breda utslagen vid 3600-3100 cm−1, se Figur 7 samt Tabell 6. Utslaget vid 3000-2800 cm−1 p̊avisar flertalet olika C-H-bindningar. Väteatomer bundet till kol är närvarande i b̊ade cellulosa, lignin och hemicellulosa, vilket gör det sv̊art att dra slutsatser fr̊an detta utslag. Enligt Tabell 7 skulle närvaro av aromatiska C-C-bindningar ge ett m̊attligt till kraftigt utslag vid 1625-1585 cm−1. Utslag vid 1630 cm−1 i Figur 7 kan förklaras med C-C-bindningar i bensen, vilket är en förening som kännetecknar lignin. Det är däremot sv̊art att säga n̊agot om ligninets kvantitet i proverna fr̊an ett IR-spektrum. Utslaget mellan v̊agtalen 1200-1000 cm−1 är n̊agot vagt i vissa prover, men skulle kunna beskrivas av C-O-bindningar i olika eterformationer och alkoholer som finns närvarande i b̊ade arabinoxylan och cellulosa. Sammanfattningsvis g̊ar det inte att utesluta närvaron av lignin med hjälp av IR- spektroskopi, d̊a C-C-bindningar som ger utslag för lignin p̊avisats. Vidare g̊ar det heller inte att utesluta närvaron av cellulosa genom IR-spektroskopi, d̊a utslag som indikerar bindningar typiska för cellulosa och arabinoxylan sammanfaller. 22 Analys med 1H-NMR (se Figur 8) visar en tydlig topp vid 4.7 ppm, samt tv̊a toppar mellan 5.2-5.4 ppm. Topparna vid 5.2-5.4 ppm p̊avisar närvaro av arabinoxylan och toppen vid 4.7 ppm indikerar xylos. Xylosmonomerer ska ha avlägsnats i dialysen och det är därför troligt att det är ändgrupper i polymeren hos arabinoxylan som syns. Att ändgrupperna syns tydligt p̊a NMR-spektrumet indikerar att polymererna är relativt korta. En viss nedbrytning av polymererna är oundviklig under delignifiering och extraktion. Lignin best̊ar till stor del av aromatgrupper och skulle resultera i en tydlig topp vid 7 ppm. Dock erh̊alls ej dessa karakteristiska toppar i spektrumet, vilket motsäger resultaten fr̊an IR- spektroskopin. Aromaternas fr̊anvaro fr̊an 1H-NMR kan förklaras i att ligninet i det extraherade materialet, likt arabinoxylan, återfinns i stora aggregat eller polymerer. Detta skulle kunna skapa mycket utbredda toppar vid 7 ppm, vilket kan ses i vissa 1H-NMR-spektrum. Under förbehandling med HCl och delignifiering med natriumklorit avlägsnades det mesta av fetterna samt lignin närvarande i kornskalen. I extraktionssteget löstes arabinoxylan i natri- umhydroxid och olösligt material filtrerades bort. Den fasta fasen bestod främst utav cellulosa men kan även ha inneh̊allit andra hydrofoba ämnen, s̊asom lignin-aggregat bundet till cellulosa. Endast lignin och cellulosa som har gjorts vattenlösligt under extraktionssteget kan ha följt med filtratet. Cellulosa är endast vattenlösligt d̊a dess polymerer har reducerats till mycket kort längd. Cellulosa är motst̊andskraftigt mot behandling av NaOH och det är därför mindre troligt att den ska ha fragmenterats. Skulle sm̊a fragment av nedbruten cellulosa trots detta bil- dats vid NaOH-behandling bör dessa försvunnit med osmos under dialysen d̊a korta sackarider kunnat passera fritt över dialysmembranet. Stora lignin-aggregat närvarande i det extraherade materialet är i sig själva inte vatten- lösliga. Dess vattenlöslighet hade kunnat förklaras av kovalenta bindningar till arabinoxylan. Eftersom syftet var att erh̊alla arabinoxylan med hög polymeriseringsgrad har milda extrak- tionsbetingelser valts, vilket förklarar att kovalent bunden lignin kan återfinnas i viss m̊an i extraktionsmaterialet. Detta stämmer även överens med den bruna färgen p̊a de extraherade proverna som varierar i nyans (se Figur 6). En ytterligare lättillgänglig metod för att fastställa kompositionen i produkten skulle vara att göra en kolhydratanalys. Detta kunde inte genomföras p̊a grund av tidsbrist. Med hjälp av kolhydratsanalys hade halten glukos, xylos och arabinos kunnat fastställas. Ur den informatinen hade det kunnat avgöras hur mycket cellulosa relativt hemicellulosa som återfunnits i det extraherade materialet. Samtligt material som extraherats visade p̊a filmbildande tendenser. Dock har utvärdering av filmernas egenskaper inte rymts inom tidsramarna för detta projekt. 6.1.1 Regressionsmodellering Modellen som framtogs (se Ekvation 31 samt Figur 9 och och 10) visade att pH och mängd NaClO2 var signifikanta för utbytet av hemicellulosa. Inom omr̊adet som undersöktes visade sig utbytet vara som lägst d̊a mängden NaClO2 antog sitt centralpunktsvärde. När mängden NaClO2 avvek fr̊an centralpunkten ökade utbytet. Det maximala utbytet över det intervall som undersöktes erhölls vid det lägsta undersökta värdet för NaClO2, vilket är positivt d̊a det innebär att mer hemicellulosa extraheras när en minskad mängd NaClO2 används. Eftersom NaClO2 är den kemikalie som används för att avlägsna lignin m̊aste fr̊agan ställas huruvida det ökade utbytet för l̊aga mängder NaClO2 beror p̊a ligninrester i produkten. Dock kunde ingen korrelation hittas mellan mängd NaClO2 tillsatt under delignifiering och färg p̊a proverna (se Figur 6). Experiment 16 (se Figur 8) fick ett väldigt högt utbyte. Det höga utbytet i kombination med att detta försök var det som hade enskilt lägst mängd NaClO2 i försöksserien gjorde att det hade hög inverkan p̊a modellens kurvatur i NaClO2-riktning. Det finns inte n̊agon anledning till att anta att detta resultat är missvisande och bör ha uteslutits vid modelleringen. Därför hade det varit lämpligt att upprepa detta försök för att se om det höga utbytet kan återskapas. Temperaturen visade sig vara insignifikant i modellen. Hade spannet mellan temperaturens hög- och l̊agvärden ökats tillräckligt hade en effekt kunnat ses, d̊a temperatur och reaktivitet är universellt korrelerade. 23 Regressionsmodellen i Figur 9 förutsp̊ar ett högt utbyte när b̊ade NaClO2 och pH antar sina lägsta undersökta värden. Samtliga försök som utfördes i denna punkt (se Tabell 10) hade högre utbyte än det genomsnittliga utbytet för de 18 tidigare extraktionerna (se Tabell 9). Att höga utbyten kunde återskapas talar för modellens trovärdighet. 6.2 Modifiering Modifieringsförsöket med EPTMAC resulterade i en produkt av pulverliknande karaktär istället för det omodifierade materialets filmbildande tendenser. 1H-NMR-spektrumet i Figur 12 visade en tydlig topp vid 3.2 ppm som inte återfanns hos den omodifierade hemicellulosan. Denna topp är typisk för trimetylammoniumgruppen; en grupp som inte är naturligt förekommande i arabinoxylan men som finns i katjoniseringsreagenset. För att fastsl̊a att reagenset bundit kovalent till hemicellulosan utfördes en analys med HSQC-NMR. I spektrumet i Figur 14 syns en topp vid (3.1; 85). Denna topp är karakteristisk för kovalent bunden EPTMAC. Det g̊ar inte att utifr̊an IR-analys dra n̊agra slutsatser gällande modifieringen, detta kan förklaras av att den tillagda gruppen maskeras av befintliga grupper (se Figur 13). Den nya NMR-toppen vid 3.2 ppm tillsammans med de synbart förändrade materiale- genskaperna talar för att modifieringen var framg̊angsrik. Att det är möjligt att katjonisera arabinoxylan utökar dess potentiella användningsomr̊aden avsevärt eftersom katjoniserade po- lysackarider idag används inom en rad olika industrier. 7 Slutsats Samtliga extraktionsförsök resulterade i olika massutbyten av material med liknande samman- sättning. Materialet som extraherades fr̊an kornskal innehöll polymerisk arabinoxylan med en viss mängd lignin bundet till sig. Kvarstoden av lignin i materialet beror sannolikt p̊a de mil- da extraktionsbetingelserna som krävdes för att förhindra nedbrytning av arabinoxylan. Det samlade materialet som extraherades visade p̊a filmbildande tendenser. Dock har utvärdering av filmernas egenskaper inte rymts inom detta projekt. En statistiskt säkerställd modell har skapats för extraktion av arabinoxylan fr̊an kornskal. Modellen skapades genom att variera tre parametrar. Tv̊a av dessa visade sig vara signifikanta inom det intervall de varierades. Temperatur var den parametern som visade sig vara insignifi- kant, vilket orsakades av att den inte varierades över ett tillräckligt stort intervall. Genom att återskapa optimala förh̊allanden med prover i större skala har modellens trovärdighet stärkts. Den del av projektet som syftat till att kemiskt modifiera hemicellulosa har lyckats. Arabi- noxylan modifierades med EPTMAC vilket kunde bevisas med hjälp av HSQC-NMR-analys, där nya kovalenta bindningar p̊avisades. Det är vidare tydligt fr̊an s̊a väl 1H-NMR som den synliga, makroskopiska förändringen att modifiering har skett. 8 Litteraturförteckning [1] V. Mittal, Renewable Polymers: Synthesis, Processing, and Technology, Wiley - Scrivener; 2012, s. 1. [2] R.A. Sheldon, ”Green and sustainable manufacture of chemicals from biomass: state of the art”, Green Chemistry, vol. 16, ss. 950-963, 2014. [3] C. Peroval et.al, “Modified arabinoxylan-based films: Grafting of functional acrylates by oxygen plasma and electron beam irradiation“, Journal of Membrane Science, vol. 233, ss. 129-139, 2004. [4] J. Hua, C. Qingqing, G. Jianhong, Z. Yang, ”Efficient extraction and characterization of polymeric hemicelluloses from hybrid poplar”, Carbohydrate Polymers, vol. 101, ss. 1005- 1012, 2014. 24 [5] K. Leppänen, P. Spetz, A. Pranovich, K. Hartonen, V. Kitunen, H. Ilvesniemi, ”Pressurized hot water extraction of Norway spruce hemicelluloses using a flow-through system”, Wood Science and Technology, vol. 45, ss. 223-236, 2011. [6] C. Lew, ”Adding Value Prior to Pulping: Bioproducts from Hemicellulose”, Global Per- spectives on Sustainable Forest Management, ss. 225-246, 2012. [7] A. Höije, M. Gröndahl, P. Tömmeraas, ”Isolation and Characterization of physiochemical and material properties of arabinoxylans from barley husk”, Carbohydrate Polymers, ss. 266-275, 2005. [8] A.M. Karaaslan, M.A. Tshabalala, G. Buschle-Diller, ”Wood hemicellulose/chitosan-based semiinterpenetrating network hydrogels: mechanical, swelling and controlled drug release properties”, BioResources, vol. 19, ss. 1036-1054, 2010. [9] A.C. Albertsson, M. Söderqvist Lindblad, E. Ranucci, M. Laus, E Giani, ”Biodegradable Polymers from Renewable Sources: Rheological Characterization of Hemicellulose-Based Hydrogels”, Biomacromolecules, vol. 6, ss. 684-690, 2005. [10] J. Lundgren, J. Helmerius, ”Integration of a hemicellulose extraction process into a biomass based heat and power plant”, Proceedings of ECOS 2009: 22nd International Conference on Efficiency, Cost, Optimization, Simulation and Environmental Impact of Energy Systems, 2009. [11] P.F. Vena, M.P. Garćıa-Aparicio, M. Brienzo, J.F. Görgens, T. Rypstra, ”Effect of Alkaline Hemicellulose Extraction on Kraft Pulp Fibers from Eucalyptus Grandis”, Journal of Wood Chemistry and Technology, vol. 33, ss. 157–173, 2013. [12] C.S. Badal, ”Hemicellulose bioconversion”, Journal of Industrial Microbiology and Biote- chnology, vol. 30, ss. 279–291, 2003. [13] M.H. Thomsen, A. Thygesen, A.B. Thomsen, ”Hydrothermal treatment of wheat straw at pilot plant scale using a three-step reactor system aiming at high hemicellulose recovery, high cellulose digestibility and low lignin hydrolysis”, Bioresource Technology, vol. 99, ss. 4221–4228, 2008. [14] F. Peng, P. Peng, F. Xu, R.C. Sun, ”Fractional purification and bioconversion of hemicel- luloses”, Biotechnology Advances, vol. 30, ss. 879–903, 2012. [15] M. Pauly et.al, ”Hemicellulose biosynthesis”, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, ss. 627- 628, 2013. [16] A.M. Stepan, ”Bioplastics from Biomass - Acetylation of Xylans with Green Chemistry”, Chalmers university of Technology, s. 9, 2013. [17] A.G.J. Voragen, G.J. Coenen, R.P. Verhoef, H.A. Schols, ”Pectin, a versatile polysaccha- ride present in plant cell walls”, Struct Chem, vol. 20, ss. 263-275, 2009. [18] A.G. Cunha, A. Gandini, ”Turning polysaccharides into hydrophobic materials: a critical review. Part 1 Cellulose”, Cellulose, vol. 17, ss. 875-889, 2010. [19] D.P. Delmer, Y Amor, ”Cellulose Biosynthesis”, The Plant Cell, Vol. 7, ss. 987-1000, 1995. [20] R.C. Sun, X.F. Sun, J. Tomkinson, Hemicelluloses and Their Derivatives, Washington DC: American Chemical Society; 2003, ss. 2-22. [Internet] Tillgänglig p̊a: ACS Publications [21] C.K. Mathews, K.E. Van Holde, D.R. Appling, S.J. Anthony-Cahill, Biochemistry 4:th edition, Upper Saddle River, New Jersey, USA: Pearson Canada Inc.; 2013: ss. 332-333. 25 [22] A. Awal, M. Sain, ”Characterization of Soda Hardwood Lignin and the Formation of Lignin Fibers by Melt Spinning”, Centre for Biocomposites and Biomaterials Processing, s. 2765, 2013. [23] R.S. Rohella, N. Sahoo, V. Chakravortty, ”Lignin Macromolecule”, Regional Research Laboratory Bhubaneswar, Department of Chemistry Utkal University Bhubaneswar, ss. 60-61, 1997. [24] A.L. Horvath, ”Solubility of Structurally Complicated Materials”, The Journal of Physical Chemisty, vol. 35, nr. 1, s. 77-92, 2006. [25] A. Edringerová, Z. Hromádková, T. Heinze, ”Hemicellulose”, Springer-Verlag Berlin Hei- delberg, vol. 186 ss. 4-5, 2005. [26] ”Korn”, Lantmännen, Citerad: 2014-05-09, [Internet], Tillgänglig p̊a: http://lantmannen.se/aktiviteter/Sadesslaget/Artiklar/Korn/ [27] H. Krawczyk, T. Persson, A. Andersson, A.S. Jönsson, ”Isolation of hemicelluloses from barley husks”, Food and Bioproducts Processing, Vol. 86, s. 31, 2008. [28] A.A. Roos, T. Persson, H. Krawczyk, Zacchi G, St̊albrand H, ”Extraction of water-soluble hemicelluloses from barley husks”, Bioresource Technology, vol. 100, s. 763, 2009. [29] A.G. Norman, ”CXCVIII. The Hemicelluloses III. extraction and preparation”, Biochem J, vol. 31, ss. 1579–1585, 1937. [30] D.N-S. Hon, N. Shiraishi, Wood and cellulosic chemistry, 2:a upplagan, New York: Marcel Dekker Inc; 2001, ss. 443-450. [31] Y. Wang, ”cellulose fiber dissolution in sodium hydroxide solution at low temperature: dissolution kinetics and solubility improvement”, Georgia Institute of Technology, 2008. [32] H.J. Prado, M.C. Matulewicz, ”Cationization of polysaccharides: A path to greener deri- vatives with many industrial applications”, European Polymer Journal, vol. 52, ss 53-75, 2014. [33] V. Bigand, C. Pinel, D. Da Silva Perez, F. Rataboul, P. Huber, M Petit-Conil, ”Catio- nisation of galactomannan and xylan hemicelluloses”, Carbohydrate Polymers, Vol. 85, ss. 138-148, 2011. [34] D.C. Montgomery, Design and analysis of experiments, 8:e internationella upplagan, Ho- boken: John Wiley & Sons; 2009, a) s. 241-248 b) s. 25-59 c) s. 254-255 d) s. 285-289 e) s. 449-466. [35] P. Atkins, L. Jones, Chemical Principles: The Quest for Insight, 5:e upplagan, New York : W.H.Freeman and Company; 2010, a) ss. 90-91 b) s. 791. [36] J. Clayden, N. Greeves, S. Warren, Organic Chemistry, New York : Oxford University Press; 2001, a) ss. 65-72 b) s. 251. [37] United States of America. National Bureau of Standards. ”Infrared Spectroscopy of Car- bohydrates: A Review of the Literature”, Washington DC: Department of Commerce, 1968. [38] J. B. Lambert, H. F. Shurvell, D. A. Lightner, R.G. Cooks, Organice Structural Spectroscopy, New Jersey: Prentice-Hall; 1998, a) ss. 188-199 b) ss. 131-133 [39] S. Bengtsson, P. Åman, ”Isolation and Chemical Characterization of Water-soluble Ara- binoxylans in Rye Grain, Carbohydrate polymers”, vol 12, ss. 267-277, 1990. [40] H. de la Motte , G. Westman , ”Regioselective cationization of cellulosic materials using an efficient solvent-minimizing spray-technique”, Cellulose, vol 19, ss. 1677–1688, 2012. 26 9 Appendix A Beräkningar A.1 Torrviktsbestämning Torrvikten p̊a startmaterialet för samtliga prov beräknades enligt Ekvation 35: torrvikt = v̊atvikt ∗ torrhetshalt (35) Utifr̊an Ekvation 35 beräknades torrvikten för de 18 prover som ingick i faktorialdesignen enligt Ekvation 36, och torrvikten för de fem optimeringsproverna enligt Ekvation 37. Värdet p̊a torrhetshalten är 88.13%. 8.813g = 10g ∗ 0.8813 (36) 17.626g = 20g ∗ 0.8813 (37) A.2 Beräkning av parametervärden vid faktorial- central- och axial- punkter ξCi = ξi+ + ξi− 2 (38) ξi = ξCi ± wi √ 3 (39) Ekvation 38 bekriver hur värdet för en parameter i i centralpunkten beräknas som medel- värdet av dess faktorialvärden ξi+ och ξi−. Ekvation 39 beskriver hur värdet för en parameter A i dess höga och l̊aga axialpunkter beräknas, där wi = ξCi − ξi− = ξi+ − ξCi. B Grafer B.1 1H-NMR I Sample Name: kandidat_prov1 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_prov1_20140414_01 FidFile: kandidat_prov1_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #73, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 4 0 . 2 0 0 . 1 7 0 . 1 7 0 . 1 3 0 . 0 6 0 . 5 0 9 5 . 9 5 0 . 2 8 0 . 1 6 0 . 2 1 0 . 2 2 0 . 1 4 0 . 2 1 0 . 2 7 0 . 2 5 0 . 2 9 0 . 1 8 0 . 4 2 0 . 1 6 ppm02468101214 Plotname: kandidat_prov1_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 15: 1H-NMR-spektrum för prov 1. Sample Name: Kandidat_2 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: Kandidat_2_20140414_01 FidFile: Kandidat_2_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #29, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec - 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 3 0 . 0 8 0 . 0 5 0 . 0 8 0 . 0 8 0 . 5 1 9 6 . 9 1 2 . 0 3 0 . 0 4 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 1 ppm02468101214 Plotname: Kandidat_2_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 16: 1H-NMR-spektrum för prov 2. II Sample Name: hemi3 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: hemi3_20140512_01 FidFile: hemi3_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 12 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #52, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec - 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 0 0 . 0 3 0 . 0 9 0 . 0 2 0 . 0 5 0 . 1 7 0 . 1 1 0 . 3 3 0 . 0 7 9 9 . 1 8 - 0 . 0 2 - 0 . 0 1 - 0 . 0 2 - 0 . 0 2 - 0 . 0 0 ppm02468101214 Plotname: hemi3_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 17: 1H-NMR-spektrum för prov 3. Sample Name: kandidat_5 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_5_20140414_01 FidFile: kandidat_5_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #75, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 4 0 . 0 3 0 . 0 2 0 . 0 3 0 . 1 1 0 . 1 0 0 . 0 9 0 . 1 8 0 . 1 4 0 . 1 7 0 . 1 8 9 4 . 9 0 0 . 2 4 0 . 1 1 0 . 0 9 0 . 0 8 0 . 1 8 0 . 3 7 0 . 5 6 0 . 1 1 0 . 1 4 0 . 1 5 0 . 3 9 0 . 2 9 0 . 2 4 0 . 2 1 0 . 0 7 0 . 5 5 0 . 2 2 ppm02468101214 Plotname: kandidat_5_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 18: 1H-NMR-spektrum för prov 5. III Sample Name: kandidat_6 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_6_20140414_01 FidFile: kandidat_6_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #76, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 2 1 0 . 7 1 9 6 . 2 4 0 . 4 5 0 . 2 6 0 . 2 4 0 . 2 8 0 . 3 4 0 . 3 1 0 . 2 4 0 . 7 2 ppm02468101214 Plotname: kandidat_6_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 19: 1H-NMR-spektrum för prov 6. Sample Name: Kandidat-7 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: Kandidat-7_20140414_01 FidFile: Kandidat-7_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #77, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 4 0 . 0 2 0 . 1 7 0 . 0 4 0 . 4 3 0 . 1 7 0 . 1 1 0 . 0 9 0 . 0 6 0 . 0 5 0 . 0 8 0 . 1 8 0 . 1 7 9 5 . 6 8 0 . 1 2 0 . 6 3 0 . 1 6 0 . 3 3 1 . 3 0 0 . 0 4 0 . 0 3 0 . 0 5 ppm02468101214 Plotname: Kandidat-7_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 20: 1H-NMR-spektrum för prov 7. IV Sample Name: Kandidat_8 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: Kandidat_8_20140414_01 FidFile: Kandidat_8_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #78, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 1 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 3 0 . 3 5 0 . 1 2 0 . 0 9 0 . 1 3 0 . 1 2 0 . 0 9 9 5 . 8 3 0 . 1 4 0 . 4 0 0 . 1 9 0 . 4 4 0 . 2 0 0 . 0 9 0 . 1 2 0 . 1 1 0 . 1 0 0 . 1 3 0 . 1 1 0 . 1 6 0 . 2 3 0 . 1 3 0 . 0 5 0 . 5 5 0 . 0 3 0 . 0 2 ppm02468101214 Plotname: Kandidat_8_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 21: 1H-NMR-spektrum för prov 8. Sample Name: kanditat_9 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kanditat_9_20140414_01 FidFile: kanditat_9_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #25, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 5 0 . 0 8 0 . 1 5 0 . 1 6 0 . 1 2 0 . 1 9 0 . 1 5 0 . 1 4 0 . 1 1 0 . 1 3 0 . 1 0 9 4 . 3 4 0 . 6 6 0 . 4 4 0 . 6 8 0 . 3 9 0 . 3 0 0 . 3 3 1 . 0 2 0 . 1 3 0 . 0 9 0 . 0 5 0 . 0 5 0 . 0 5 ppm02468101214 Plotname: kanditat_9_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 22: 1H-NMR-spektrum för prov 9. V Sample Name: kandidat_10 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_10_20140414_01 FidFile: kandidat_10_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #26, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 6 0 . 1 1 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 3 9 4 . 6 4 0 . 2 5 0 . 2 1 0 . 1 8 0 . 1 4 0 . 1 4 0 . 4 0 0 . 2 8 0 . 3 1 0 . 2 3 0 . 4 8 0 . 3 6 0 . 3 5 0 . 1 5 0 . 2 5 0 . 6 3 0 . 2 6 ppm02468101214 Plotname: kandidat_10_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 23: 1H-NMR-spektrum för prov 10. Sample Name: kandidat_11 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_11_20140414_01 FidFile: kandidat_11_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #27, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 6 0 . 0 7 0 . 1 1 0 . 1 6 0 . 1 4 0 . 1 5 0 . 1 9 0 . 1 6 0 . 2 0 0 . 0 6 0 . 1 4 9 4 . 0 0 0 . 2 4 0 . 2 5 0 . 2 1 0 . 3 2 0 . 1 2 0 . 4 4 0 . 2 6 0 . 4 8 0 . 3 8 0 . 3 5 0 . 3 4 0 . 0 8 0 . 9 0 0 . 1 1 0 . 0 4 ppm02468101214 Plotname: kandidat_11_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 24: 1H-NMR-spektrum för prov 11. VI Sample Name: kandidat_13 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_13_20140414_01 FidFile: kandidat_13_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: Apr 14 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #28, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 6 0 . 1 1 0 . 1 8 9 4 . 5 4 0 . 2 9 0 . 1 7 0 . 1 3 0 . 2 3 0 . 3 4 0 . 1 7 0 . 5 5 0 . 2 1 0 . 2 1 0 . 3 6 0 . 5 2 0 . 3 6 0 . 4 8 0 . 7 5 0 . 3 4 ppm02468101214 Plotname: kandidat_13_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 25: 1H-NMR-spektrum för prov 13. Sample Name: hemi14 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: hemi14_20140512_01 FidFile: hemi14_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 12 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #53, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec - 0 . 0 0 0 . 1 9 9 9 . 4 9 0 . 3 2 ppm02468101214 Plotname: hemi14_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 26: 1H-NMR-spektrum för prov 14. VII Sample Name: hemi15 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: hemi15_20140512_01 FidFile: hemi15_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 12 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #54, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 0 . 0 3 9 9 . 9 7 0 . 0 1 ppm02468101214 Plotname: hemi15_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 27: 1H-NMR-spektrum för prov 15. Sample Name: kandidat_hemi_16 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_hemi_16_20140508_01 FidFile: kandidat_hemi_16_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 8 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #70, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 1 0 0 . 0 0 ppm02468101214 Plotname: kandidat_hemi_16_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 28: 1H-NMR-spektrum för prov 16. VIII Sample Name: kandidat_hemi_17 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_hemi_17_20140508_01 FidFile: kandidat_hemi_17_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 8 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #71, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 1 0 0 . 0 0 ppm02468101214 Plotname: kandidat_hemi_17_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 29: 1H-NMR-spektrum för prov 17. Sample Name: kandidat_hemi18 Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: kandidat_hemi18_20140508_01 FidFile: kandidat_hemi18_PROTON_001_d2o Pulse Sequence: PROTON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 8 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #72, Operator: gunnar Relax. delay 1.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 2.556 sec Width 6410.3 Hz 8 repetitions OBSERVE H1, 399.9415180 MHz DATA PROCESSING FT size 32768 Total time 0 min 29 sec 1 0 0 . 0 0 ppm02468101214 Plotname: kandidat_hemi18_PROTON_001_d2o_plot01 Figur 30: 1H-NMR-spektrum för prov 18. IX B.2 13C-NMR Sample Name: hemi_EPTMAC Data Collected on: agilent400-vnmrs400 Archive directory: /home/Walkup/vnmrsys/data/gunnar Sample directory: hemi_EPTMAC_20140512_01 FidFile: hemi_EPTMAC_CARBON_001_d2o Pulse Sequence: CARBON (s2pul) Solvent: d2o Data collected on: May 12 2014 Temp. 25.0 C / 298.1 K Sample #68, Operator: gunnar Relax. delay 5.000 sec Pulse 45.0 degrees Acq. time 1.311 sec Width 25000.0 Hz 1024 repetitions OBSERVE C13, 100.5653747 MHz DECOUPLE H1, 399.9435177 MHz Power 38 dB continuously on WALTZ-16 modulated DATA PROCESSING Line broadening 0.5 Hz FT size 65536 Total time 1 hr, 47 min ppm020406080100120140160180200220 Plotname: hemi_EPTMAC_CARBON_001_d2o_plot01 Figur 31: 13C-NMR-spektrum för modifierat prov. C MATLAB-algoritm clc clear all clf hold off %Bygg designmatris %(1) A B C X1 =[ 1 −1 −1 −1 1 1 −1 −1 1 −1 1 −1 1 1 1 −1 1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 sqrt(3) 0 0 1 −sqrt(3) 0 0 1 0 sqrt(3) 0 1 0 −sqrt(3) 0; 1 0 0 sqrt(3) 1 0 0 −sqrt(3) ]; I = X1(:,1); X a = X1(:,2); b = X1(:,3); c = X1(:,4); X = [I a b b.^2] %Den slutgiltiga funktionen. Det gar att lagga till eller ta bort kontraster, %men dessa visade sig optimala efter en iterativ process med statistiska tester pa regr. n = length(X); %Antal matpunkter p = size(X); p = p(2); %Antal parametrar beta k = p−1; %Antal beta bortraknat I %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Svarsvariabel, matvarden y=[ 1.79 1.8 2.09 1.6 2.04 1.75 1.82 1.7 1.68 1.58 1.5 1.35 2.14 1.75 2.23 1.5 1.8]; %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Tar diagonalvardesmatris C, anvands till berakning av %regressionskoefficienter B samt t−test av dessa. C = inv(X'*X); %Berakning B B = C*X'*y; %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning Sum of Squares Error SSE = y'*y − B'*X'*y %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning varians sigmakvadrat var = SSE/(n−p) %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning t−varden. tzero = zeros(p,1); for i = 1:p tzero(i) = B(i)/sqrt(var*C(i,i)); end tzero = abs(tzero); tscore = tzero − tinv(.95,(n − k − 1)) %negativa varden har betyder insignifikant koefficient %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning SST (Total) SST = y'*y − ((sum(y))^2)/n; %Berakning SSR (Regression) SSR = SST − SSE; %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning R2 och R2adj, matt pa hur val modellen passar. Om R2 och R2adj %skiljer sig mycket ar det, utOm rimligt tVivel, sannolikt att overflodiga termer ar med. XI R2 = SSR/SST R2adj = 1 − (SSE/(n−p))/(SST/(n−1)) %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning F0 MSR = SSR/k; MSE = SSE/(n−k−1); Freg = MSR/MSE; Fscore = Freg − finv(.99, k, n − k − 1) %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Berakning Lack of Fit; yC = mean(y(9:11)); SSPE = sum((y(9:11) − yC).^2); SSLOF = SSE − SSPE; m = 9; MSPE = SSPE/(n−m); MSLOF = SSLOF/(m−p); Flof = MSLOF/MSPE − finv(.95, m−p, n−m); if Flof > 0 'Lack of fit' end %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− %Quadratic effects yF = mean(y(1:8)); yC = mean(y(9:11)); SSPQ = 8*3 * (yF−yC)^2 / (8 + 3); Fqe = SSPQ / MSPE − finv(.95, 1, n−m); if Fqe > 0 'Quadratic effects' end %−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− % B % [x1,x2] = meshgrid(−sqrt(3):0.1:sqrt(3)); % [x11] = .5.*x1 + 4; % [x22] = .4.*x2 + 2.2; % hold on %domainezsurf = [−2,2,−2,2] %ezsurf('1.6736−0.1613.*x1−0.0715.*x2+0.1192.*x2.^2', domainezsurf) % xlabel('pH') % ylabel('Natriumklorit') % zlabel('Utbyte') %scatter3(a,b,y) % Kod ovan plottar y mot kodade variabler % hold on % domainezsurf = [3,5,1.5,3] % ezsurf('1.6736−0.1613.*(x1 − 4)/.5−0.0715.*(x2 − 2.2)/.4+0.1192.*((x2 − 2.2)/.4).^2', domainezsurf); % xlabel('pH') % ylabel('Natriumklorit') % zlabel('Utbyte') % scatter3((a.*0.5 + 4),(b.*0.4 + 2.2), y); %Kod ovan plottar y mot ickekodade variabler x1=linspace(3,5,20); x2=linspace(1.5,3,20); [XA,XB]=meshgrid(x1,x2); Z=@(XA,XB)1.6736−0.1613.*(XA − 4)/.5−0.0715.*(XB − 2.2)/.4+0.1192.*((XB − 2.2)/.4).^2; % contourf(XA,XB,Z(XA,XB)); %konturplot % colormap(hot); andrat fargschema % colorbar; %lagger till colorbar pa sidan % h = colorbar; % title(h,'Hemicellulosa') % xlabel('pH') XII % ylabel('Natriumklorit') surf(XA,XB,Z(XA,XB),'facealpha', 0.7) %for 3dplot istallet hold on shading interp camlight right %lighting phong material dull grid on, box on scatter3((a.*0.5 + 4),(b.*0.4 + 2.2), y, 'b'); xlabel('pH') ylabel('Natriumklorit') zlabel('Hemicellulosa') XIII