
 
Uttryck av antimikrobiella peptider i jäst
som en metod att förhindra bakteriekontamination vid industriell
fermentation

Johanna Asserlind
Angelica Gylling
Frida Larsson
Alexander Radenkovic
Lotta Savonen Floderus
Victor Verdier

Kandidatarbete KBTX01-14-04
Institutionen för kemi- och bioteknik
Chalmers tekniska högskola
Göteborg, Sverige, 2014


Sammanfattning

Ett problem under industriella jästfermentationer är förekomsten av kontaminerande
bakterier i systemen, som kan försämra produktutbytet. För att förebygga detta pro-
blem kan konventionell antibiotika tillsättas under fermentationsprocessen, n̊agot som
bidrar till utvecklingen av antibiotikaresistenta bakterier. En mer h̊allbar ersättning till
antibiotika kan vara antimikrobiella peptider, som är peptider med en bakteriedödande
effekt.

Syftet med studien var att genmodifiera de tv̊a jäststammarna Saccharomyces cere-
visiae JBA och S. cerevisiae CEN.PK113-7D till att uttrycka de antimikrobiella pep-
tiderna L50A fr̊an Enterococcus faecium och humant β-defensin-3, samt undersöka om
dessa peptider hade n̊agon detekterbar avdödningseffekt p̊a Lactobacillus buchneri och
Lactobacillus brevis, när de uttrycktes av jästen.

Avdödningseffekten av den genmodifierade jästen p̊a Lactobacillus brevis och Lacto-
bacillus buchneri undersöktes med ympningsförsök mellan de genmodifierade jäststam-
marna och Lactobacillus, som är en vanligt förekommande kontaminant under industriella
jästfermentationer.

En lyckad genmodifiering av jäststammarna verifierades med PCR och gelelektrofore-
ser. Ympningsförsöken som gjordes för att undersöka de genmodifierade jäststammarnas
avdödande effekt p̊a Lactobacillus gav inga entydiga resultat. Detta p̊a grund av osäkra
mätvärden fr̊an ympningsförsöken.


Abstract

A problem during industrial yeast fermentations is the presence of contaminating bac-
teria in the systems, that may decrease the product yield. To prevent this problem,
conventional antibiotics are sometimes added during the fermentation process, which
contributes to the development of antibiotic-resistant bacteria. A more durable replace-
ment for antibiotics may be antimicrobial peptides, which are peptides with a germicidal
effect.

The purpose of this study was to genetically modify the two yeast strains Saccha-
romyces cerevisiae JBA and S. cerevisiae CEN.PK113-7D to express the antimicrobial
peptides L50A from Enterococcus faecium and human β-defensin-3. The purpose was
also to investigate whether these peptides had a detectable killing effect on Lactobacillus
buchneri and Lactobacillus brevis, when expressed by the yeast.

The killing effect of the genetically modified yeasts on Lactobacillus brevis and Lacto-
bacillus buchneri was investigated by conducting inoculations of the genetically modified
yeast strains and Lactobacillus, which is a common contaminant during industrial yeast
fermentations.

Successful genetic modifications of the yeast strains were verified by PCR and gel
electrophoresis. The inoculations conducted to investigate the genetically modified yeast
strains’ killing effect on Lactobacillus yielded no conclusive results. This was due to
uncertain measurements from the inoculations.


Inneh̊all

1 Inledning 1
1.1 Syfte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Avgränsningar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2 Teori 2
2.1 Antimikrobiella peptider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2.1.1 L50A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1.2 β-defensin-3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2 Genmodifierad jäst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2.1 Promotor och terminator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2.2 Ledarsekvens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.3 Kontaminerande bakterier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.1 Lactobacillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.2 Lactobacillus brevis och Lactobacillus buchneri . . . . . . . . . . . 8

3 Material och metod 8
3.1 Amplifiering av plasmider genom transformation in i E. coli . . . . . . . . 8
3.2 Extraktion och verifiering av m̊alplasmider bland upptagna plasmider fr̊an

E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.3 Amplifiering av insert till transformation av jäststammar . . . . . . . . . 9
3.4 Transformation av jäststammar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.5 Ympning av Lactobacillus med jäst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

4 Resultat och diskussion 11
4.1 Verifieringar med gelelektrofores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

4.1.1 Verifiering av m̊alplasmider fr̊an E. coli . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.1.2 Verifiering av linjärt insert för jästtransformation . . . . . . . . . . 14
4.1.3 Verifiering av insert i jästgenomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.2 Ympkulturer med bakterier och jäst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2.1 Ympkulturer med Lactobacillus och S. cerevisiae CEN.PK . . . . 18
4.2.2 Ympkulturer med Lactobacillus och S. cerevisiae JBA . . . . . . . 22

5 Slutsats 25
5.1 Förslag p̊a vidare studier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Referenser 27

Bilagor 31

A Ledarsekvens 31

B Beställda gensekvenser 32


C Målplasmider (amplifierade E. coli-plasmider) 33
C.1 L50A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
C.2 β-defensin-3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

D Linjärt insert för inkorporering i jästgenomet 39
D.1 L50A-insert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
D.2 β-defensin-3-insert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

E Protokoll för transformation av jäst 42

F Beräkningar 43
F.1 Exempelberäkning av förväntade band . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
F.2 Koncentration, medelvärde, standardavvikelse och medelfel . . . . . . . . 43

G Räkning av kolonier 44

H Grafer över koncentrationsförändring av bakterier och jästceller i ymp-
kulturer 47


1 Inledning

Jästfermentering utnyttjas av flera olika industrier för framställning av etanol eller and-
ra produkter. Jästen bryter ner sockerarter till alkohol vid öl- och vinproduktion och
utnyttjas av bagerier för att jäsa degen och göra den luftig, d̊a den producerar koldioxid.
Jästfermentering är även grunden för bioetanolproduktion. Gemensamt för dessa indu-
strier är att det krävs kontrollerbara processer för att f̊a fram den önskvärda produkten.
Jästen m̊aste verka under rätt förutsättningar för att uppn̊a ett effektivt produktut-
byte. Detta kräver att förh̊allandena i fermentorsystemen är optimerade med avseende
p̊a näringsämnen, temperatur, pH och syrehalt. (Gibson et al., 2007, Lin et al., 2012)

Ett problem inom jästbaserade fermentationsprocesser p̊a industriell niv̊a är kontami-
nering av bakterier i systemen. Bakteriekontamination p̊averkar produktiviteten genom
att reducera jästens tillväxt och inhibiera produktutbytet, vilket kan f̊a b̊ade tidsödande
och ekonomiska konsekvenser (Beckner et al., 2011, Chang et al., 1995). Till de vanligast
kontaminerande bakteriestammarna hör bakterier av släktet Lactobacillus, som frodas
under samma levnadsförh̊allanden som är optimala för m̊anga jäststammar (Jespersen
och Jakobsen, 1996, Weber et al., 2008, Skinner och Leathers, 2004).

För att åtgärda problemet med kontaminerande bakterier odlas jästen ibland i l̊agt
pH, en metod som inte alltid är tillförlitlig (Gibson et al., 2007). En studie av Albers
et al. (2011) visade att tillsats av NaCl och etanol kunde reducera bakterietillväxt vid
fermentation av trähydrolysat. Denna metod kan dock vara problematisk p̊a industriell
niv̊a, p̊a grund av till̊atna gränsvärden för natriumjoner i slutprodukten, där avlägsnan-
det av överflödiga joner skulle innebära ett kostnadsp̊alägg i produktionen (C. Larsson,
personlig kommunikation, 15 maj 2014). I dagsläget används ibland även antibiotika för
att reducera bakterietillväxten i fermentorsystemen (Compart et al., 2013). Denna typ
av konventionell antibiotikaanvändning bidrar till utvecklingen av antibiotikaresistenta
bakteriestammar, vilket är ett växande problem i dagens samhälle (Levy, 2002).

Om alternativet hade funnits att effektivt minska bakteriekontaminering i system
med jästfermentering, utan att använda konventionell antibiotika, vore detta mer h̊all-
bart, b̊ade ekonomiskt och ur miljösynpunkt. En metod för att åstadkomma detta skulle
kunna vara att f̊a jästen att uttrycka antimikrobiella peptider som kan bekämpa bakte-
rierna i systemen. Jästen skulle d̊a p̊a egen hand kunna utföra samma arbete som den
tillsatta antibiotikan gör idag (James et al., 2013, Jin et al., 2013). Den konventionella
antibiotikan som idag används har funktioner som bekämpar väldigt specifika processer
i bakterier, n̊agot som gör dess effektivitet känslig för mutationer i bakterierna. Detta
problem skulle kunna undvikas med antimikrobiella peptider, eftersom de har en mer
generell effekt mot bakteriernas cellmembran (Chan et al., 2006).

Att genmodifiera jästen till att uttrycka antimikrobiella peptider kan göras genom
att ett insert, inneh̊allande en gensekvens som kodar för en antimikrobiell peptid, förs
in i jästens genom via homolog rekombination (Jin et al., 2013). Insertet behöver även
inneh̊alla en ledarsekvens för att de uttryckta peptiderna ska transporteras ut ur jästens
cellmembran (Das et al., 1989).

1


1.1 Syfte

Syftet med studien var att framställa tv̊a genmodifierade jäststammar som uttryckte de
antimikrobiella peptiderna L50A fr̊an Enterococcus faecium och humant β-defensin-3,
samt undersöka om dessa genmodifierade jäststammar hade n̊agon detekterbar avdöd-
ningseffekt p̊a Lactobacillus buchneri och Lactobacillus brevis.

1.2 Avgränsningar

Studien var begränsad till att undersöka tv̊a olika peptider: L50A, som visat en anti-
mikrobiell effekt p̊a Lactobacillus (Basanta et al., 2009), och β-defensin-3, som visat sig
reducera bakteriekontamination vid öltillverkning (James et al., 2013). Jäststammarna
som användes var Sacharromyces cervisiae JBA, en svensk industriell bagerijäststam,
och S. cervisiae CEN.PK, en laboratoriestam. Effekten av de uttryckta peptiderna fr̊an
de olika jäststammarna undersöktes p̊a tv̊a olika stammar av släktet Lactobacillus, d̊a
studier visat att bakterier ur detta släkte är de vanligast förekommande kontaminanterna
vid industriell jästfermentering (Jespersen och Jakobsen, 1996, Weber et al., 2008).

2 Teori

Följande avsnitt behandlar teori och begrepp som är centrala för denna studie. Det
som beskrivs är antimikrobiella peptider, med fokus p̊a L50A och β-defensin-3, samt
teori kring genmodifierng av jäststammarna Saccharomyces cervisiae JBA och S. cer-
visiae CEN.PK, med sekvenser kodandes för dessa antimikrobiella peptider. Dessutom
beskrivs effekten av kontaminerande bakterier under jästfermentering, med en fördjupad
beskrivning av bakteriestammarna Lactobacillus brevis och Lactobacillus buchneri.

2.1 Antimikrobiella peptider

Antimikrobiella peptider är ribosomproducerade peptider med antimikrobiell effekt. De
är en naturligt förekommande del av det ospecifika immunförsvaret hos multicellulära
organismer, men förekommer även hos encelliga organismer, och är därmed en utbredd
företeelse bland m̊anga livsformer. De antimikrobiella peptiderna är ett viktigt försvar
mot mikroorgansimer och kan delas in i ett flertal olika grupper och undergrupper.
Antimikrobiella peptider fr̊an bakterier kallas för bakteriociner. (Guilhelmelli et al., 2013)

Gemensamt för bakteriociner och eukaryotiska antimikrobiella peptider är att de är
sm̊a (20 till 50 aminosyror), katjoniska och hydrofoba eller amfifila (Hassan et al., 2012).
En viktig skillnad är dock att bakteriociner oftast är verksamma redan vid piko- till na-
nomolära koncentrationer, medan det krävs mikromolära koncentrationer för aktivitet
fr̊an eukaryotiska antimikrobiella peptider (Nissen-Meyer och Nes, 1997). Många bakte-
riociner har ett väldigt smalt spektrum, det vill säga att de endast är aktiva mot ett
f̊atal arter eller ett släkte, ofta väldigt närbesläktade med den bakteriocinproduceran-
de bakterien ifr̊aga (Nissen-Meyer och Nes, 1997), medan eukaryotiska antimikrobiella
peptider generellt är mindre specifika (Hassan et al., 2012).

2


Till skillnad fr̊an konventionell antibiotika, som ofta angriper en specifik process i
bakterier, angriper m̊anga antimikrobiella peptider cellmembranet p̊a vad som verkar
vara mer av ett semispecifikt sätt. De angripna cellerna dör genom bildanden av porer
i cellmembranet och den initiala mekanismen som möjliggör detta involverar ofta at-
traktiva krafter mellan en positivt laddad antimikrobiell peptid och en negativt laddad
cellmembranyta. Till följd av en del antimikrobiella peptiders (i synnerhet vissa bakte-
riociners) höga specificitet mot endast ett f̊atal arter spekuleras det dock att de även
binder till specifika receptorer p̊a cellen i fr̊aga, och n̊agra s̊adana bakteriocinreceptorer
har de facto identifierats. (Hassan et al., 2012).

Mekanismen för antimikrobiella peptider tros, bland annat p̊a grund av dess semis-
pecifika angreppsätt mot cellmembranen, vara mycket sv̊arare för mikroogranismer att
utveckla resistens mot, jämfört med konventionell antibiotika (Boman, 2003, Hancock
och Sahl, 2006, Hancock, 1997). Trots detta har dock n̊agra resistensmekanismer till
antimikrobiella peptider identifierats (Gunn, 2008, Kraus och Peschel, 2008).

För att skydda sig fr̊an sina egna antimikrobiella peptider har bakterier ibland gener
som medför immunitet mot peptiderna (Nes et al., 1996, Hassan et al., 2012). Dessa gener
är ofta lokaliserade i närheten av genen till den antimkrobiella peptiden och regleras p̊a
samma eller snarliknande sätt (Hassan et al., 2012). Mekanismen för hur dessa proteiner
medför immunitet är i vissa fall oklar. I andra fall har mekanismen klarlagts, exempelvis
under en studie av Diep et al. (2007), där immunitetsproteinet visade sig binda till
bakteriocinreceptorn, p̊a den bakteriocinproducerande bakteriens cellmembran, p̊a ett
s̊adant sätt att bakteriocinen inte kunde binda där, vilket omöjliggjorde porbildning.

Det är i litteraturen inte alltid tydligt vad som är skillnaden mellan antimikrobiella
peptider och antibiotika, och antimikrobiella peptider kallas ibland rent av för antibio-
tika. Beroende p̊a vilken definition p̊a antibiotika som tillämpas kan detta vara korrekt.
En enkel och ofta använd avskiljning mellan antimikrobiella peptider och konventionell
antibiotika är dock att konventionell antibiotika inte är ribosomalt syntetiserade (Papa-
gianni, 2003) och att konventionell antibiotika, till skillnad fr̊an antimikrobiella peptider,
inte är peptider.

2.1.1 L50A

L50A är en 44 aminosyror l̊ang plasmidkodad bredspektrum-bakteriocin producerad av
vildtypsstammen Enterococcus faecium L50. I själva verket kodar genen för tv̊a peptider,
L50A och L50B, som har 72% sekvenshomologi (Cintas et al., 1998). De är b̊ada sm̊a,
katjoniska och hydrofoba och in vitro transkriptions/translationsexperiment tyder starkt
p̊a att de ej är posttranslationellt modifierade (Cintas et al., 1998). De syntetiseras hos E.
faecium L50 mellan 16 ◦C och 42 ◦C, och optimalt vid en temperatur p̊a 25 ◦C (Criado
et al., 2006).

I en studie av Basanta et al. (2008) visade sig E. faecium L50 verka hämmande mot 26
av 34 undersökta vanliga öl-kontaminerande mikroorganismer (bl.a. Lactobacillus brevis
NFBC108 och Pediococcus damnosus CECT4797), alla tillhörande familjen Lactobacilla-
ceae. Samma studie indikerade ocks̊a att dessa antimikrobiella bred-spektrumegenskaper
hos E. faecium L50 främst kunde tillskrivas produktionen av L50 (A och B). Vidare

3


klargjordes det att b̊ade L50A och L50B innehar antimikrobiell effekt utan närvaro av
varandra, men att de b̊ada peptiderna tillsammans innehar en kraftigare antimikrobiell
effekt än motsvarande additiva effekt av peptiderna, var för sig (s̊a kallad synergistisk
effekt, även antydd innan av Cintas et al. (1998)). När peptidernas effekt jämförts med
varandra har dock L50A visat sig ha större antimikrobiell effekt än L50B (Cintas et al.,
1998, Basanta et al., 2008, 2009). Studien av Basanta et al. (2008) visade sedermera
p̊a en varierande grad av antimikrobiell verkan av L50A beroende p̊a vilket steg i öl-
bryggningsprocessen som var aktuellt, men att det är möjligt att helt eliminera L. brevis
NFBC108 fr̊an vört och färdig lageröl även vid höga kontaminationsniv̊aer (4-5 · 105

CFU/ml), och att L50 klarar de temperaturbehandlingar som generellt används inom
bryggningsindustrin.

I ytterligare en studie av Basanta et al. (2009) har stammar av Saccharomyces cerevi-
siae modifierats med stabila plasmider inneh̊allande genen för L50A, L50B eller L50AB,
med varierande resultat. Bland annat visade sig L50AB-mutanten endast producera
L50A och inte L50B, och de observerade maximala mängderna av L50A och L50B fr̊an
de modifierade jäststammarna motsvarade bara 4 respektive 11 procent av den maxi-
malt observerade produktionen hos E. faecium L50. Resultaten ans̊ags änd̊a i stora drag
som lovande (Basanta et al., 2009), men att fler studier krävs för att optimera bakterio-
cinproduktion, öka bakteriocinstabiliteten under oxidativ stress och uppn̊a kombinerad
produktion av L50A och L50B med en och samma genmodifierade jäststam.

2.1.2 β-defensin-3

Defensiner är sm̊a katjoniska antimikrobiella peptider som utgör ett led mellan det ospe-
cifka och det adaptiva immunförsvaret i b̊ade växter och djur (Yang et al., 1999). I
däggdjur är de indelade i α-, β- eller θ-defensiner beroende p̊a sekvenshomologi och dis-
tributionen av disulfidbindingar mellan sex konservativa cysteinregioner (Klotman och
Chang, 2006).

Den antimikrobiella effekten hos defensiner beror p̊a deras katjoniska laddning, som
till̊ater dem att elektrostatiskt binda till de negativt laddade plasmamembranen hos olika
mikroorganismer. P̊a s̊a vis försvagas strukturen p̊a plasmamembranen och de börjar
läcka, vilket resulterar i att mikroorganismen dör (White et al., 1995).

Humant β-defensin-3 är en 45 aminosyror l̊ang antimikrobiell peptid som är verksam
inom ett brett spektrum, mot s̊aväl grampositiva som gramnegativa bakterier, svam-
par och adenovirus (Hoover et al., 2003). James et al. (2013) undersökte effekten av
β-defensin-3 mot en rad vanliga kontaminanter vid ölproduktion, fr̊an släktena Lacto-
bacillus, Pediococcus and Pectinatus. Studien visade att s̊a mycket som 95 procent av
bakteriekontaminationen kunde begränsas in vitro. En signifikant effekt mot bakteri-
ekontamination, bland annat av L. brevis, uppmättes även när peptiden integrerades
i genomet p̊a lagerjästen Saccharomyces pastorianus och uttrycktes under fermenta-
tionsförh̊alladen, p̊a pilotskala. James et al. (2013) kunde även dra slutsatsen att jästen
utsöndrade peptiden, men att den till stor del satt kvar p̊a jästens cellyta. En syntetisk

4


version av peptiden tillsattes i buteljerad öl och även där uppmättes en signifikant effekt
mot kontaminerande bakterier (James et al., 2013).

2.2 Genmodifierad jäst

En väl beprövad metod för att genmodifiera jäst är att introducera en gen i jästgenom-
et via homolog rekombination. I denna studie används homolog rekombination för att
inkorporera insertet (Figur 1), inneh̊allande genen för n̊agon av de antimikrobiella pep-
tiderna, 1000 baspar nedströms om stop-kodonet i DAK2, en gen belägen p̊a kromosom
6 i Saccharomyces cerevisiae.

I studien användes S. cerevisiae-stammarna JBA och CEN.PK113-7D. JBA är en
tetraploid, svensk industriell bagerijäststam fr̊an Jästbolaget AB, Rotebro, som har vi-
sat sig vara relativt etanoltolerant (Albers och Larsson, 2009). CEN.PK113-7D är en
haploid laboratoriestam som används frekvent i laboratoriestudier p̊a grund av dess
snabba tillväxt. Dessutom inneh̊aller dess genom gener som återfinns b̊ade hos industri-
ella stammar och laboratoriestammar, vilket gör den fördelaktig att använda i jästförsök.
(Canelas et al., 2010, Nijkamp et al., 2012).

Figur 1: Visualisering av insertet (orange) i jästgenomet. TDH3p (lila) är en promotor för
valfri inkorporerad gen, β-def-3 eller L50A (grön), flankerad av alfaledaren (gul). ADH1-t
(brun) är en terminator för att avsluta transkriptionen av den inkorporerade genen. Kan-
MX (röd) är en kanamycinresistensgen (med tillhörande promotor och terminatorsekvenser)
som möjliggör selektering av jäst som inkorporerat insertet i genomet. För att säkerställa
att insertet inkorporerats p̊a rätt plats i jästgenomet används primrar som binder till se-
kvenser strax uppströms (DAK2 ctrl up) och nedströms (DAK2 ctrl dw) om det omr̊ade
där insertet önskas inkorporeras. Dessa kombineras med TDH3p rev och KanMX fw i tv̊a
PCR-omg̊angar, där produkten ska bli tv̊a segment om 498 bp (övre) och 744 bp (nedre).
DAK2 up och DAK2 dw kan användas för att amplifiera insertet med hjälp av PCR.

2.2.1 Promotor och terminator

I studien användes en TDH3-promotor och en ADH1-terminator för att kunna uttrycka
de antimikrobiella peptiderna i de genmodifierade jäststammarna.

TDH3 (triosfosfatdehydrogenas-3) är en gen i S. cerevisiae kodande för
glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH), ett glykolytiskt enzym, som är det mest
förekommande proteinet i jästen (Esnault et al., 1993). Det finns tre olika gener i jäst-
genomet som kodar för GAPDH (Holland et al., 1983): TDH1, TDH2 och TDH3. Av

5


dessa är det TDH3 som visat sig transkriberas mest (McAlister och Holland, 1985), och
promotorn (eller viktiga delar av promotorn) till TDH3 har därför utnyttjats flitigt till
att åstadkomma en hög expression av heterologa gener i olika experiment, exempelvis
av Yoshimura et al. (1987), Kuroda et al. (1992) och Kniskern et al. (1986). TDH3-
promotorn är en stark s̊a kallad konstitutiv promotor, vilket innebär att den är aktiv
i alla normalt förekommande odlingsförh̊allanden i laboratorie-, pilot- och industriskala
(Kuroda et al., 1994).

ADH1 är en gen i S. cerevisiae som kodar för alkoholdehydrogenas-1, som bryter
ned acetaldehyd till etanol i glykolysen (Bennetzen och Hall, 1982). ADH1-terminatorn
är stark och därför en vanligt förekommande terminator i biotekniska försök med jäst
(Ghazal et al., 2009, Dobi och Winston, 2007, Bennetzen och Hall, 1982).

2.2.2 Ledarsekvens

För att säkerställa att de antimikrobiella peptiderna lämnar jästcellen efter translation,
behöver en ledarsekvens integreras i det insert som förs in i jästens genom. När denna
ledarsekvens uttrycks ihop med önskad peptid, guidas de uttryckta peptiderna genom
den korrekta sekretoriska vägen och ut genom cellmembranet. En s̊adan ledarsekvens är
den α-ledare som ursprungligen är kodad fr̊an genen MFα1 (Bitter et al., 1984, Flessel
et al., 1989).

MFα1 kodar för en preprotein-α-faktor, som är 165 aminosyror l̊ang (Kurjan och
Herskowitz, 1982). Detta preprotein best̊ar av en 19 aminosyror l̊ang signalpeptid, som
orsakar en förflyttning av preproteinet till det endoplasmatiska nätverket (ER), och en 64
aminosyror l̊ang region som inneh̊aller tre platser för glykosylering. I sin glykosylerade
form tros regionen leda preproteinet genom rätt reaktionsväg i cellen. De resterande
82 aminosyrorna best̊ar av fyra upprepningar av en α-faktorsekvens, som åtskiljs av
länkande peptider. α-faktorsekvenserna kan bytas ut mot valfri gen, som kommer att
bearbetas p̊a samma sätt som om den vore en α-faktorsekvens. (Bitter et al., 1984,
Caplan et al., 1990)

I ER p̊abörjas preproteinets posttranslationella modifieringar där peptiden glykolsye-
ras och signalsekvensen klyvs, vilket omvandlar preproteinet till en pro-α-faktor. Pepti-
den förs vidare till golgiapparaten där ytterligare glykosyleringar tillkommer. Ett antal
olika enzymer i golgiapparaten bryter sedan särskilda peptidbindningar i pro-α-faktorn.
Endopeptidaset KEX2 klipper vid N-terminalen p̊a varje länkande peptid och bildar fyra
α-faktorpeptider, varp̊a STE13 klipper bort de återst̊aende aminosyrorna av de länkande
peptiderna fr̊an α-faktorerna. Dessa utsöndras slutligen ut i det extracellulära mediet.
(Julius et al., 1984a,b, Caplan et al., 1990)

I denna studie kommer endast en del av α-ledaren att användas, best̊aende av 89
aminosyror fr̊an α-ledarens N-terminal (Bilaga A). Denna oligopeptid best̊ar av de 64
plus 19 aminosyror som leder peptiden genom rätt reaktionsväg, samt en länkande peptid
för att säkerställa att proteinet f̊ar de egenskaper som eftersöks (Polyak et al., 1997).
Nedströms α-ledaren, där α-faktorsekvenserna vanligtvis sitter, placeras genen till den
peptid som jästen ska utsöndra, L50A eller β-defensin-3. P̊a s̊a sätt kan även främmande
protein utsöndras av jästcellens naturliga mekanismer.

6


2.3 Kontaminerande bakterier

Vid jästfermentationer för produktion av etanol beror behovet av en semisteril omgiv-
ning till stor del p̊a produktens natur. Vid livsmedelsproduktion s̊asom vin och andra
alkoholhaltiga drycker krävs en miljö s̊a fri som möjligt fr̊an oönskade kontaminationer,
för att försäkra sig om en produkt med önskad kvalitet och smak (Suzuki et al., 2006).
Vid produktion av etanol, till exempelvis drivmedel, ligger inte fokus p̊a en semisteril
miljö utan syftet är främst att f̊a ett s̊a högt produktutbyte som möjligt. Detta kan, utan
behandling av exempelvis antibiotika, innebära en ökad risk för förekomst av produk-
tionsinhiberande bakterier (Bischoff et al., 2007). I en studie av Skinner och Leathers
(2004) p̊avisades att vanligt förekommande grupper av kontaminerande bakterier i eta-
nolfermentationer med jäst, är arter av mjölksyrabakterier samt Bifidobacter. Albers
et al. (2011) konstaterar även att förekomst av Acetobacter kan inhibera etanolproduk-
tionen vid bioetanolframställning.

2.3.1 Lactobacillus

Lactobacillus är grampositiva, stavformade bakterier som tillhör gruppen mjölksyrabak-
terier. Mjölksyrabakterier karakteriseras av deras förm̊aga att bryta ned hexoser till
främst mjölksyra, men även ättiksyra (Kandler, 1982). Lactobacillus delas in i tre un-
dergrupper: obligat homofermentativa, fakultativt heterofermentativa och obligat hete-
rofermentativa (Du Toit et al., 2001). Majoriteten tillhör den första kategorin (Kandler,
1982). Obligat homofermentativa Lactobacillus-stammar använder sig främst av glyko-
lysen, i vilken glukos bryts ned till pyruvat och sedan mjölksyra. Heterofermentativa
stammar använder en annan reaktionsväg, pentosfosfatvägen, som producerar mjölksy-
ra, men även ättiksyra och etanol (Kandler, 1982).

Lactobacillus används ofta som startkultur i m̊anga växtbaserade fermentationer,
exempelvis för produktion av ensilage. Detta för att inhibera jästtillväxt, vilket skulle
kunna leda till förstört foder. Lactobacillus används ocks̊a tillsammans med jäst vid bak-
ning av surdeg för att förhindra tillväxt av mögel eller som startkultur i mjölkprodukter,
s̊asom yoghurt och ost. (Filya et al., 2006, Corsetti et al., 1998).

Vid förekomst av Lactobacillus i en fermentation med jäst konkurrerar de tv̊a or-
ganismerna med varandra om näring (hexoser, s̊asom glukos), vilket kan leda till en
inhibering av jästens tillväxt (Alexander, 1971). Detta kan även ske genom Lactobacillus
produktion av mjölksyra, vars olösta form kan ta sig in i jästcellens cytosol och inhibera
tillväxt. Tillväxt av Lactobacillus leder allts̊a till att jästen har mindre substrat att till-
g̊a för att växa och producera etanol, vilket minskar lönsamheten vid etanolproduktion
(Beckner et al., 2011, Chang et al., 1995).

I studien användes tv̊a arter för att undersöka de genmodifierade jäststammarnas anti-
mikrobiella effekt: Lactobacillus brevis och Lactobacillus buchneri.

7


2.3.2 Lactobacillus brevis och Lactobacillus buchneri

L. brevis och L. buchneri är b̊ada heterofermentativa arter som i anaeroba eller mikro-
aeroba förh̊allanden producerar mjölksyra, acetat och etanol fr̊an hexoser, s̊asom glukos,
galaktos och xylos (Sharpe, 1979, Kandler, 1982, Liu et al., 2007). L. brevis har en opti-
mal tillväxttemperatur p̊a ca 30 ◦C och växer d̊aligt över 37 ◦C (Bergey et al., 1923). L.
buchneri har en optimal tillväxttemperatur p̊a mellan 32 och 37 ◦C, men klarar tempera-
turer p̊a upp till 40-44 ◦C (Bergey et al., 1923). Detta till trots, s̊a finns det flertalet olika
stammar under b̊ade L. brevis och L. buchneri som har olika specifika egenskaper s̊asom
optimal tillväxttemperatur och pH-tolerans (Sharpe, 1979). Detta gör dem toleranta för
varierande förh̊allanden i system med jästfermentation.

3 Material och metod

I följande avsnitt beskrivs de metoder som användes under studien. Dessa inkluderar
amplifiering, med hjälp av Escherichia coli, av de plasmider med insert som skulle trans-
formeras in i de tv̊a jäststammarna JBA och CEN.PK. Avsnittet inkluderar även meto-
der för extraktion och verifiering av plasmiderna, samt transformering och verifiering av
de amplifierade inserten för respektive jäststam. Dessutom beskrivs den ympning som
gjordes av de tv̊a genmodifierade jäststammarna med Lactobacillus brevis och Lactobac-
illus buchneri, för att undersöka bakteriernas tillväxt i förh̊allande till de genmodifierade
jäststammarnas.

3.1 Amplifiering av plasmider genom transformation in i E. coli

Plasmider inneh̊allande gensekvenser för L50A respektive β-defensin-3, med tillhöran-
de ledarsekvenser, beställdes fr̊an GenScript (Bilaga B). Dessa gensekvenser klipptes ut
fr̊an vardera plasmid med restriktionsenzymerna BamHI och AscI och verifierades med
en post-stained gel och gelelektrofores (80 V, 60 min). Gensekvenserna renades ut fr̊an
gelen med hjälp av Thermo Scientifics ”GeneJET Gel Extraction Kit”, varp̊a de ligera-
des in i vektorer (pUC57-TDH3-EFE-vektorer) med ampicillin- och kanamycinresistens,
homologisekvenser för jäst samt promotor respektive terminator för den inkorporerade
genen. Gensekvenserna ersätter EFE-delen av vektorn vid ligering och dessa konstruktio-
ner benämns vidare som m̊alplasmider (Bilaga C). Olika molration (gensekvens/vektor)
användes vid ligeringen för att öka sannolikheten för en lyckad ligering. Plasmider trans-
formerades genom heat shock in i E. coli DH5α. Transformationen av E. coli utnyttjades
för amplifiering av m̊alplasmider (Bilaga C). Selektering av E. coli med upptagna plasmi-
der genomfördes genom att bakterierna odlades p̊a LB+ampicillin-plattor (10g/l pepton,
10 g/l NaCl, 5g/l jästextrakt, 16 g/l agar, 80 mg/l ampicillin). Endast de bakterier som
tagit upp plasmider inneh̊allande genen för ampicillinresistens överlevde. Bakterierna
kultiverades över natt i 37 ◦C värmesk̊ap.

8


3.2 Extraktion och verifiering av m̊alplasmider bland upptagna plasmi-
der fr̊an E. coli

Miniprep-kulturer förbereddes genom att kolonier fr̊an tv̊a plattor med E. coli som trans-
formerats med L50A med tv̊a olika molration (gensekvens/vektor), 3:1 och 5:1, samt
kolonier fr̊an en platta med E. coli som transformerats med β-defensin-3, molratio 3:1,
valdes ut. Totalt 10 kolonier fr̊an respektive platta plockades och överfördes till Eppen-
dorfrör med 2 ml LB-medium+ampicillin (50 µg/ml). Eppendorfrören sattes i 37 ◦C
skakinkubator över natt.

Plasmider extraherades fr̊an odlingarna med hjälp av Thermo Scientifics ”GeneJET
Plasmid Miniprep Kit”, och m̊alplasmider verifierades med gelelektrofores (80 V, 40 min)
efter att de klippts med restriktionsenzymerna HindIII och PvuII (Figur 2). Ytterliga-
re verifiering av respektive m̊alplasmid genomfördes efter klippning med dels AscI och
BamHI, och dels med MfeI, följt av gelelektrofores (80 V, 40 min, Figur 3).

3.3 Amplifiering av insert till transformation av jäststammar

PCR (98 ◦C i 10 s, 53 ◦C i 30 s, 72 ◦C i 2 min, 30 cykler, 72 ◦C i 10 min) genomfördes
med primrarna DAK2 up och DAK2 dw (Tabell 1) p̊a 10x- respektive 100x-spädningar
av m̊alplasmider fr̊an utvalda kolonier av E. coli, för att amplifiera de insert (Bilaga D)
som sedan transformerades in i jästen. Verifiering av PCR-produkterna för respektive
insert utfördes b̊ade med och utan klippning med MfeI, följt av gelelektrofores (75 V, 40
min, Figur 4).

Tabell 1: I metoden använda primrar.

Primer Sekvens

DAK2 up 5’-CATGCATCTAAGAAATCAACCTATATC-3’

DAK2 dw 5’-CAATTTAAAACGGCTCAAATCATTTG-3’

DAK2 ctrl up 5’-GTAGTTGATTCTTGTTCTACCAATTAGTG-3’

DAK2 ctrl dw 5’-GATGTCTACATCGTCAGAACTAAGTG-3’

TDH3p rev 5’-TGGACCTATGAACTGATGGTTGGTG-3’

KanMX fw 5’-GTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACG-3’

3.4 Transformation av jäststammar

Kulturer av jäststammarna JBA och CEN.PK odlades i Falconrör över natten i YPD-
medium (20 g/l glukos, 20g/l pepton, 10 g/l jästextrakt) i 30 ◦C. Transformation av jäst-
stammarna skedde enligt angivet protokoll (Bilaga E), följt av utstryk p̊a YPD-plattor
med Geneticin, G418 (20 g/l glukos, 20g/l pepton, 10 g/l jästextrakt, 20 g/l agar, 200
µg/ml G418). G418 är en kanamycinanalog som bryts ned av kanamycinresistensgenen

9


i insertet som jäststammarna transformerades med (Bilaga D). Plattorna inkuberades i
tre dygn i 30 ◦C.

Efter tre dygn gjordes en andra utstrykning av fyra större kolonier fr̊an vardera platta
med de genmodifierade jäststammarna, p̊a YPD-plattor med G418 (200 µg/ml), för att
ytterligare selektera för kolonier där homolog rekombination av insertet lyckats. De fyra
plattorna inkuberades i 30 ◦C över natten.

För att verifiera att inserten inkorporerats p̊a rätt plats i jäststammarnas genom,
extraherades genomen med hjälp av MP Biomedicals ”FastDNA Spin Kit for Soil”, var-
p̊a verifiering av rekombinationen av insertet utfördes med PCR (98 ◦C i 10 s, 57 ◦C
i 30 s, 72 ◦C i 30 s, 30 cykler, 72 ◦C i 10 min, dels med primrarna DAK2 ctrl up och
TDH3p rev, dels med primrarna DAK2 ctrl dw och KanMX fw (Tabell 1) följt av gele-
lektrofores (80 V, 45 min, Figur 5 och 6).

Tv̊a Lactobacillus-stammar, L. buchneri (LB-16) och L. brevis (SE-31), som skulle an-
vändas för att undersöka den bakteriedödande effekten hos den genmodifierade jästen,
ströks ut p̊a MRS-plattor och odlades upp i 30 ◦C.

3.5 Ympning av Lactobacillus med jäst

För att undersöka den bakteriedödande effekten av de b̊ada antimikrobiella peptiderna,
uttryckta av de tv̊a genmodifierade jäststammarna, gjordes en ympning av de genmo-
difierade jäststammarna, tillsammans med L. buchneri och L. brevis. För att avgöra
vilka spädningar av förkulturer som skulle användas när antalet kolonier av jäststam-
mar och Lactobacillus-bakterier skulle räknas, förbereddes kulturer av de genmodifiera-
de jäststammarna, samt av vildtyperna av JBA och CEN.PK i separata Falconrör med
YPD-lösning. I ytterligare ett Falconrör förbereddes en kultur av b̊ada de uppodlade
Lactobacillus-stammarna. Dessa inkuberades över natt i 30 ◦C. När de uppn̊att OD över
2 gjordes ympkulturer av dessa (10 ml YPD + 1 ml jästkultur + 1 ml bakteriekultur)
som odlades p̊a skakinkubator i 30 ◦C. En spädningsserie med spädningar om 10x ut-
fördes fr̊an dessa ympkulturer och spädningarna placerades som droppar om 10 µL p̊a
YPD- och MRS+cykloheximid-plattor, varp̊a de inkuberades i 30 ◦C. Nya plattor förbe-
reddes p̊a samma sätt, av samma ympkulturer, efter 3 och 6 timmar efter att de första
plattorna inkuberats.

Nya ympkulturer förbereddes därefter med en mindre mängd Lactobacillus (10 ml
YPD + 1 ml jästkultur + 0,25 ml bakteriekultur) och spädningarna 105 och 106 under-
söktes. 100 µL av varje spädning spreds p̊a b̊ade YPD- och MRS+cykloheximid-plattor
om dubbelprov och inkuberades i 30 ◦C. Nya plattor förbereddes efter 3, 6 och 24 tim-
mar efter att de första plattorna inkuberats. Kolonierna som uppstod efter tv̊a dygns
inkubering räknades. Cykloheximiden dödade jästcellerna vilket gjorde det möjligt att
endast studera bakteriekolonier p̊a MRS+cykloheximid-plattorna. P̊a YPD-plattorna
gick det att se skillnad p̊a jäst- och bakteriekolonier vilket gjorde det möjligt att studera
jästtillväxten p̊a dessa plattor.

Antalet kolonier p̊a plattorna användes för att beräkna jäst- och bakteriekoncentra-
tionen i varje ympkultur (Bilaga F).

10


4 Resultat och diskussion

Detta avsnitt behandlar resultaten av de verifieringar som gjordes för att säkerställa en
lyckad genmodifiering av de tv̊a jäststammarna, JBA och CEN.PK. Avsnittet behand-
lar även resultatet av den ympning som gjordes med respektive jäststam tillsammans
med Lactobacillus buchneri och Lactobacillus brevis, för att undersöka de genmodifierade
jässtammarnas avdödande effekt p̊a dessa bakterier.

4.1 Verifieringar med gelelektrofores

Nedan följer resultat och diskussion av de verifierande gelelektroforeser som utfördes
under studien. Detta inkluderar verifiering av att m̊alplasmider inkorporerats och amp-
lifierats i Escherichia coli (Figur 2 och 3), att rätt insert amplifierats fr̊an dessa plasmi-
der (Figur 4) och att de transfomerats och inkorporerats p̊a rätt plats i jäststammarnas
genom (Figur 5 och 6). En exempelberäkning p̊a förväntade bandstorlekar för gelelektro-
foreserna presenteras i Bilaga F.

4.1.1 Verifiering av m̊alplasmider fr̊an E. coli

Resultatet fr̊an kontrollen av de extraherade plasmiderna, där transformationen av E.
coli verifierades, visade att L50A och β-defensin-3 hade ligerats in i vektorerna i en
majoritet av de undersökta kolonierna (Figur 2). Förväntade längder p̊a banden fr̊an
de uppklippta plasmiderna inneh̊allande L50A eller β-defensin-3 presenteras i Tabell 2,
respektive Tabell 3. Figur 2 visar att resultatet av L50A-plasmiden (vänstra gelen) gav
fyra av fem laddade brunnar som motsvarar de förväntade längderna p̊a banden. Den
första brunnen fr̊an vänster saknar band motsvarande 1526, 892 och 776 bp. De övriga
brunnarnas band stämmer överens med de förväntande längderna, vilket tyder p̊a en
lyckad ligering av gensekvenserna med pUC57-TDH3-EFE-vektorerna.

Resultatet fr̊an kontrollen av β-defensin-3-plasmiden (Figur 2, högra gelen) visar
ocks̊a fyra av fem brunnar med förväntade längder p̊a banden. Det näst största bandet
i den andra brunnen fr̊an vänster är n̊agot längre än motsvarande i övriga brunnar, och
det förväntade bandet p̊a 892 bp saknas. Med undantag för de tv̊a nämnda brunnarna
gav kontrollen av de extraherade plasmiderna fr̊an de olika kolonierna de förväntade
m̊alplasmiderna.

11


Figur 2: Kontroll av de, fr̊an olika kolonier av E. coli, extraherade plasmiderna (Bilaga
C) inneh̊allande genen för L50A (vänster gel) eller β-defensin-3 (höger gel), klippta med
restriktionsenzymerna HindIII och PvuII.

Tabell 2: Brunnar och förväntade band i Figur 2 fr̊an kontrollen av L50A-plasmider ex-
traherat fr̊an E. coli.

Plasmid: L50A L50A L50A L50A L50A

Molratio

(gensekvens/vektor): 3:1 3:1 5:1 5:1 5:1

Koloni: 1 2 1 2 3

REs: HindIII HindIII HindIII HindIII HindIII

PvuII PvuII PvuII PvuII PvuII

Storlek (bp): 2364 2364 2364 2364 2364

1526 1526 1526 1526 1526

892 892 892 892 892

776 776 776 776 776

12


Tabell 3: Brunnar och förväntade band i Figur 2 fr̊an kontrollen av β-defensin-3-plasmider
extraherat fr̊an E. coli.

Plasmid: β-def. β-def. β-def. β-def. β-def.

Molratio

(gensekvens/vektor): 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1

Koloni: 1 2 3 4 5

REs: HindIII HindIII HindIII HindIII HindIII

PvuII PvuII PvuII PvuII PvuII

Storlek (bp): 2364 2364 2364 2364 2364

1529 1529 1529 1529 1529

892 892 892 892 892

776 776 776 776 776

Fr̊an gelelektroforesen i Figur 3 bekräftades det ytterligare att plasmiderna extrahe-
rade ur olika kolonier av E. coli var korrekta i en majoritet av fallen. Klippningen med
MfeI fastställde skillnaden mellan de tv̊a m̊alplasmiderna, d̊a detta restriktionsenzym
klippte i genen för L50A, men inte i genen för β-defensin-3. Detta gjordes för att sä-
kerställa att ingen förväxling hade skett mellan de tv̊a olika m̊alplasmiderna. Det syns
tydligt i de tv̊a sista brunnarna i Figur 3 att restriktionsenzymet har klippt tv̊a g̊anger
i m̊alplasmiden inneh̊allande L50A; en g̊ang i vektorn och en g̊ang i själva genen, men
endast en g̊ang i vektorn inneh̊allande genen för β-defensin-3.

13


Figur 3: Kontroll av de, fr̊an olika kolonier av E. coli, extraherade plasmiderna (Bilaga C),
klippta med AscI och BamHI (brunn 1-4). För att säkerställa att de b̊ada m̊alplasmiderna
innehöll rätt gensekvens gjordes även en kontroll med restriktionsenzymet MfeI (de tv̊a sista
brunnarna) som klipper i L50A-genen men inte i β-defensin-3-genen.

Tabell 4: Brunnar och förväntade band fr̊an kontrollen av plasmider i Figur 3.

Plasmid: L50A β-def. L50A β-def. L50A β-def.

Molratio

(gensekvens/vektor): 5:1 3:1 3:1 3:1 5:1 3:1

Koloni: 1 1 2 3 1 1

REs: BamHI BamHI BamHI BamHI MfeI MfeI

AscI AscI AscI AscI

Storlek (bp): 5149 5149 5149 5149 4971 5561

409 412 409 412 587

4.1.2 Verifiering av linjärt insert för jästtransformation

Samtliga laddade brunnar i Figur 4 visar de förväntade bandstorlekarna för PCR-
produkterna (Tabell 5). Ett svagare band kunde dock urskiljas, i synnerhet i brunnarna
laddade med oklippt PCR-produkt som spätts 100 g̊anger innan PCR-reaktionen. Det
finns ingen uppenbar förklaring till detta kortare fragment p̊a ca 1800 bp. D̊a intensite-
ten p̊a detta band jämfört med det förväntade bandet var väldigt svag, och endast det
korrekta bandet lär inneh̊alla homologiregioner till jäst, ans̊ags resultatet vara tillräck-
ligt bra för att transformera jäststammarna med PCR-produkten. Proverna L50A 10x
och β-def. 10x (Tabell 5) valdes ut till jästtransformationen, d̊a det oväntade bandet var

14


svagast för dessa spädningar.

Figur 4: Verifiering av korrekt PCR-produkt (linjärt insert för transformering av jäst,
Bilaga D). De fyra första brunnarna laddades med oklippt PCR-produkt och de fyra sista
brunnarna laddades med PCR-produkt klippt med MfeI.

Tabell 5: Brunnar och förväntade band för verifiering av PCR-produkt i Figur 4. Med
spädning avses spädning innan PCR-reaktionen p̊abörjades.

Insert: L50A L50A β-def. β-def. L50A L50A β-def. β-def.

Spädning: 10x 100x 10x 100x 10x 100x 10x 100x

RE: - - - - MfeI MfeI MfeI MfeI

Storlek (bp): 3185 3185 3188 3188 2093 2093 2683 2683

587 587 505 505

505 505

4.1.3 Verifiering av insert i jästgenomen

För verifiering av insert p̊a korrekt plats i jästgenomen genomfördes tv̊a PCR-reaktioner
med olika primrar enligt Figur 1. Längderna p̊a de erh̊allna banden i Figur 5 stämde
överens med de förväntade längderna för PCR-amplifieringen av den övre delen av in-
serten i jästgenomen (Tabell 6). De prov som späddes 10 g̊anger innan PCR-reaktionen
gav dock svagare band, samt ett mycket kort band, som skulle kunna vara primrar.

15


Figur 5: Verifiering av att övre delen av inserten har inkorporerats p̊a korrekt plats i
jästgenomen (Figur 1). Verifieringen gjordes med hjälp av gelelektrofores av en PCR av
jästgenomen med primrarna DAK2 ctrl up och TDH3p rev (Tabell 1). Förväntade storlekar
för samtliga prov var 498 bp.

Tabell 6: Brunnar och förväntade band för verifiering av övre delen av inserten i jästgeno-
men. Med spädning avses spädningen innan PCR-reaktionen p̊abörjades.

Stam: JBA JBA JBA JBA CEN.PK CEN.PK CEN.PK CEN.PK

Mutant: L50A L50A β-def. β-def. L50A L50A β-def. β-def.

Spädning: outspädd 10x outspädd 10x outspädd 10x outspädd 10x

Storlek (bp): 498 498 498 498 498 498 498 498

Verifieringen av den nedre delen av inserten i jästgenomen var ocks̊a framg̊angsrik, d̊a
längderna p̊a de erh̊allna banden i Figur 6 stämde överens med de förväntade längderna
(Tabell 7). Den första brunnen, laddad med den outspädda PCR-amplifieringen av den
nedre delen av L50A-insertet fr̊an JBA, visade dock inget band överhuvudtaget. En
möjlig förklaring till detta är att inget DNA, utan endast loading dye, fanns i lösningen
som brunnen laddades med. D̊a samma del av insertet som spätts 10 g̊anger innan
PCR-reaktionen gav korrekt band, ökar sannolikheten att inget DNA laddades i den
första brunnen. Figur 5 och 6 bekräftar att b̊ada verifieringarna lyckades, vilket innebär
att inserten inkorporerades p̊a rätt plats i genomen, och att samtliga jäststammar blev
korrekt genmodifierade.

16


Figur 6: Verifiering av att nedre delen av inserten har inkorporerats p̊a korrekt plats i
jästgenomen (Figur 1). Verifieringen gjordes med hjälp av gelelekrofores av en PCR av
jästgenomen med primrarna DAK2 ctrl dw och KanMX fw (Tabell 1). Förväntade storlekar
för samtliga prov var 744 bp.

Tabell 7: Brunnar och förväntade band för Figur 6. Med spädning avses spädningen innan
PCR-reaktionen p̊abörjades.

Stam: JBA JBA JBA JBA CEN.PK CEN.PK CEN.PK CEN.PK

Mutant: L50A L50A β-def. β-def. L50A L50A β-def. β-def.

Spädning: outspädd 10x outspädd 10x outspädd 10x outspädd 10x

Storlek (bp): 744 744 744 744 744 744 744 744

4.2 Ympkulturer med bakterier och jäst

Efter kultivering enligt avsnitt 3.5 räknades de kolonier av Lactobacillus som vuxit p̊a
plattor med MRS+cykloheximid (Tabell 8, Bilaga G). Cykloheximiden p̊a dessa plattor
inhibierade jästtillväxten, vilket innebar att endast bakterier fr̊an de tv̊a Lactobacillus-
stammarna kunde växa. Antalet bakteriekolonier räknades om till totalkoncentration av
bakterier i respektive ympkultur (Figur 13 och 14, Bilaga H), genom att multiplicera an-
talet kolonier p̊a plattorna med spädningsfaktorn och dividera med den tillsatta volymen
av ympkultur p̊a plattan (Tabell 8, Bilaga G). Koncentrationen av bakterier vid de olika
tidpunkterna dividerades med startkoncentrationen av bakterier i respektive ympkultur,
för att f̊a fram en procentuell tillväxt i förh̊allande till startkoncentration för bakterierna
(Figur 7 och 10). Detta för att de olika startkoncentrationerna av bakterier och jäst
skiljde sig åt mellan ympkulturerna. P̊a samma sätt beräknades den procentuella till-
växten i förh̊allande till startkoncentration för de olika jäststammarna (Figur 8 och 11).
Jästkoncentrationen i ympkulturerna vid olika tidpunkter beräknades genom att räkna
antalet jästkolonier som växt p̊a YPD-plattor (Tabell 9, Bilaga G) och relatera antalet
till totalkoncentrationen av jästceller i ympkulturerna (Figur 8 och 11).

Förh̊allandet mellan bakterier och jäst i de olika ympkulturerna jämfördes (Figur 9
och 12), genom att dividera koncentrationen av bakterier (Figur 13 och 14, Bilaga H)
med koncentrationen av jäst (Figur 15 och 16, Bilaga H), vid varje mätpunkt. Jämfö-
relsen gjordes för att försöka minimera p̊averkan av de spädningsfel som uppstod under

17


utstryken av ympkulturer p̊a de olika MRS+cykloheximid- och YPD-plattorna.
Att spädningsfelen varit stora kan man se p̊a de koloniantal som uppstod p̊a de olika

plattorna (Tabell 8 och 9, Bilaga G). En tiopotens skiljer mellan varje spädning, vilket bör
resultera i tio g̊anger s̊a m̊anga kolonier p̊a plattan med lägre spädning. Skillnaden mel-
lan antalet bakteriekolonier för de olika spädningarna p̊a MRS+cykloheximid-plattorna
skiljer sig ofta endast med en faktor 3 eller 4, och p̊a n̊agon platta har antalet kolonier till
och med varit högre p̊a plattan som varit spädd tio g̊anger s̊a mycket (Tabell 8, Bilaga
G). Samma tendens gällde plattorna med YPD, som användes för att beräkna koncent-
rationen av jästceller i de olika ympkulturerna (Tabell 9, Bilaga G). Dessa spädningsfel
tros bero p̊a att pipettspetsarna inte byttes mellan varje spädning, under varje enskild
spädningsserie, som gjordes av ympkulturerna för utstryk p̊a alla plattor vid 0, 3 och 6
timmar. Pipettspetsarna byttes dock under spädningsserierna av ympkulturerna för ut-
stryk vid 24 timmar, för vilka plattorna även generellt visar mer förväntade koloniantal
(Tabell 8 och 9, Bilaga G).

Vidare hade vissa plattor inga kolonier alls för n̊agra av utstrykningarna, vilket tros
bero p̊a ett missöde under kultiveringen, d̊a dessa plattor stod för nära en värmefläkt i det
rum där de sattes att tillväxa. Dessa värden har tagits bort vid alla utförda beräkningar
(Tabell 8 och 9, Bilaga G). De generellt osäkra spädningarna och odlingsföh̊allandena för
alla plattor p̊averkar naturligtvis även resultaten, eftersom alla vidare beräkningar som
gjorts för att tolka den bakteriedödande effekten hos jäststammarna, bygger p̊a räkning
av antalet kolonier p̊a de olika plattorna. Detta gör resultaten mycket osäkra och inga
definitiva slutsatser bör dras direkt ur kommande figurer.

4.2.1 Ympkulturer med Lactobacillus och S. cerevisiae CEN.PK

I Figur 7 presenteras den procentuella tillväxten i förh̊allnade till startkoncentration av L.
brevis och L. buchneri vid ympning med CEN.PK vildtypsjäst, CEN.PK genmodifierad
med L50A eller CEN.PK genmodifierad med β-defensin-3, vid olika tidpunkter. Bakte-
rietillväxten har undersökts genom odling p̊a MRS+cykloheximidplattor. En signifikant
minskad bakterietillväxt uppvisas för b̊ade CEN.PK L50A och CEN.PK β-defensin-3,
jämfört med bakterietillväxten i CEN.PK vildtypsjäst, efter 3 timmar. Efter 6 timmar
kan en signifikant skillnad av bakterietillväxt endast detekteras mellan vildtypsjästen
och jästen modifierad med β-defensin-3, där den procentuella tillväxten i förh̊allande till
startkoncentration, varit signifikant mindre i den genmodifierade jäststammen.

Efter 24 timmar har bakteriekoncentrationen i alla ympkulturer sjunkit markant,
vilket tyder p̊a en naturlig avdödning, troligtvis p̊a grund av näringsbrist (Figur 7).
Att näringsbrist är en trolig orsak till avdödningen av bakterier i alla ympkulturer med
CEN.PK efter 24 timmar kan stärkas vid jämförelse med Figur 8, som visar den pro-
centuella jästtillväxten i förh̊allande till startkoncentration, för samma ympkulturer, där
även jästen visar en avdödning fram till denna tid.

18


0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30

P
ro

ce
n

t 
av

 s
ta

rt
ko

n
ce

n
tr

at
io

n
 a

v
L
a
c
t
o
b
a
c
il
lu
s

Tid [h]

CEN.PK wt

CEN.PK L50A

CEN.PK β-def.

Figur 7: Procentuell tillväxt i förh̊allnade till startkoncentration av L. brevis och L. buchneri
över tid, d̊a de ympats ihop med vildtypen av CEN.PK (bl̊a), CEN.PK genmodifierad med
L50A (röd) eller CEN.PK genmodifierad med β-defensin-3 (grön). Tillväxten har beräknats
fr̊an fyra olika MRS+cykloheximid-plattor, tv̊a med 105-spädning och tv̊a med 106-spädning
(Tabell 8, Bilaga G). Plattorna var behandlade med cykloheximid för att inhibiera tillväxt
av jästceller. Punkterna i grafen är medelvärdet av bakterietillväxten, beräknad fr̊an de fyra
plattorna, för respektive jäststam. Felstaplarna visar medelfelet (Bilaga F).

Figur 8 visar den procentuella tillväxten i förh̊allnade till startkoncentration av
CEN.PK vildtypsjäst, CEN.PK genmodifierad med L50A eller CEN.PK genmodifierad
med β-defensin-3 vid ympning med L. brevis och L. buchneri, vid olika tidpunkter. Fi-
guren visar en signifikant skillnad i jästtillväxt mellan de olika ympkulturerna av b̊ada
genmodifierade stammar av CEN.PK och vildtypsjäst efter 3 timmar, där vilstypsjäs-
ten vuxit signifikant bättre (Figur 8). Denna figur kan användas som ett komplement
till Figur 7, för att bekräfta att ett eventuellt minskat bakterieantal i ympkulturerna
inte enbart beror p̊a till exempel odlingsförh̊allanden. En minskad bakteriekontamina-
tion i ympkulturerna borde rimligtvis vara följden av en hög koncentration av antimi-
krobiella peptider och därmed även en hög koncentration av jäst i ympkulturen. Det-
ta skulle leda till att de signifikant lägre värdena av bakterier för de genmodifierade
CEN.PK-jäststammarna i Figur 7 efter 3 timmar även skulle visa en signifikant hög-
re koncentration av jästceller vid samma tid (Figur 8). Detta är dock inte fallet, och
den signifikanta skillnad som uppvisades mellan bakterietillväxten för de genmodifiera-
de CEN.PK-stammarna och vildtypsjästen (Figur 7) beror därför antagligen inte p̊a de
antimikrobiella peptiderna, utan snarare p̊a spädningsfelen. Om ett samband skulle ha
uppvisats, kunde avdödningen av bakterier änd̊a inte med säkerhet kunnat tillskrivas en
hög effekt av de antimikrobiella peptiderna. Detta för att ingen studie har gjorts p̊a vare
sig translation eller utsöndring av de antimikrobiella peptiderna, av de genmodifierade
jäststammarna.

19


0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 10 20 30

P
ro

ce
n

t 
av

 s
ta

rt
ko

n
ce

n
tr

at
io

n
 a

v
jä

st

Tid [h]

CEN.PK wt

CEN.PK L50A

CEN.PK β-def.

Figur 8: Procentuell tillväxt i förh̊allnade till startkoncentration av vildtypen av CEN.PK
(bl̊a), CEN.PK genmodifierad med L50A (röd) eller CEN.PK genmodifierad med β-defensin-
3 (grön) d̊a de ympats med L. brevis och L. buchneri. Tillväxten har beräknats fr̊an fyra
olika YPD-plattor, tv̊a med 105-spädning och tv̊a med 106-spädning (Tabell 8, Bilaga G).
Punkterna i grafen är medelvärdet av jästtillväxten, beräknad fr̊an de fyra plattorna för
respektive jäststam. Felstaplarna visar medelfelet (Bilaga F).

Figur 9 visar hur L. brevis och L. buchneri har vuxit i förh̊allande till vildtypen
av CEN.PK, CEN.PK genmodifierad med L50A eller CEN.PK genmodifierad med β-
defensin-3 i respektive ympkultur. Denna jämförelse har gjorts för att minska resultatens
p̊averkan av de spädningsfel som konsekvent gjordes under utstryken p̊a plattor under
hela studien. Eftersom utstryken p̊a plattor gjordes fr̊an samma spädningsserie för att
undersöka b̊ade bakterietillväxten och jästtillväxten i ympkulturerna, borde spädnings-
felet som uppstod vara detsamma p̊a b̊ada typer av plattor. Därför bör kvoten mellan
den beräknade bakteriekoncentrationen och jästkoncentrationen i ympkulturerna ge en
mer korrekt bild av förh̊allandet i ympkulturerna än vad som kan urläsas enbart ur Figur
7 och Figur 8.

Ur Figur 9 kan urläsas att förh̊allandet mellan koncentrationen av jästceller och
koncentrationen av Lactobacillus har varit signifikant olika i ympkulturerna vid inku-
beringsstart, med en högre andel bakterier i ympkulturen för CEN.PK β-defensin-3,
jämfört med de tv̊a andra CEN.PK-stammarna. Jäststammarna i de olika ympkulturer-
na har därför sannolikt haft olika förutsättningar att konkurrera med bakterierna fr̊an
början, vilket kan ha p̊averkat resultatet.

Vid 3 timmar syns en drastisk minskning av bakterier jämfört med jästceller i ymp-
kulturen hos b̊ade CEN.PK vildtyp och CEN.PK β-defensin-3, men inte hos CEN.PK
L50A (Figur 9). Detta kan bero p̊a att jästen har kommit in i logfasen snabbare än
Lactobacillus, d̊a dennes förkultur var YPD. Lactobacillus odlades i förkultur med MRS
vilket kan ha gett en längre lagfas, d̊a bakterierna behövt anpassa sig till det nya medi-

20


et. Att detta inte skett med CEN.PK L50A beror sannolikt p̊a att b̊ada resultaten fr̊an
106-spädningarna har försakats d̊a plattorna inte innehöll n̊agra jästkolonier (Tabell 9,
Bilaga G). Detta gör den beräknade koncentrationen för CEN.PK L50A mer osäker vid
denna tidpunkt vilket i sin tur kan ha ökat ratiot mellan Lactobacillus och jäst (Figur
9).

Vid 6 timmar kan konstateras att CEN.PK L50A haft en signifikant begränsande
effekt p̊a tillväxten av bakterier i förh̊allande till de andra CEN.PK-jäststammarna.
Denna effekt avtar fram till 24 timmar, d̊a ingen signifikant skillnad längre kan detekteras
mellan vildtypsjästen och CEN.PK L50A. CEN.PK β-defensin-3 har fr̊an 3 till 6 timmar
inte visat n̊agon signifikant skillnad fr̊an CEN.PK vildtyp. Däremot kan man efter 24
timmar se en signifikant högre andel bakterier i förh̊allande till jäst i ympkulturen för
β-defensin-3. Hänsyn bör dock tas till att startkoncentrationer av bakterier i CEN.PK
β-defensin-3 var signifikant högre än den var hos b̊ade vildtypsjästen och den andra
mutanten, vilket kan ha försämrat grundförutsättningarna för CEN.PK β-defensin-3 att
tillväxa p̊a samma sätt (Figur 9).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 10 20 30

R
at

io
 m

e
lla

n
L
a
c
t
o
b
a
c
il
lu
s

o
ch

C
EN

.P
K

Tid [h]

CEN.PK wt

CEN.PK L50A

CEN.PK β-def.

Figur 9: Förh̊allande mellan Lactobacillus-stammarna och vildtypen av CEN.PK (bl̊a),
CEN.PK genmodifierad med L50A (röd) och CEN.PK genmodifierad med β-defensin-3
(grön) för respektive ympkultur. Tillväxten har beräknats fr̊an fyra olika MRS-plattor, tv̊a
med 105-spädning och tv̊a med 106-spädning, samt fyra YPD-plattor med samma spädning-
ar (Tabell 8, Bilaga G). Resultatet fr̊an MRS+cykloheximid-plattorna har dividerats med
YPD-plattorna för att eliminera spädningsfel. MRS-plattorna var behandlade med cyklohex-
imid för att inhibiera tillväxt av jästceller. Punkterna i grafen är medelvärdet av förh̊allandet
mellan varje MRS- och YPD-platta vid given tidpunkt. Felstaplarna visar medelfelet (Bilaga
F).

21


4.2.2 Ympkulturer med Lactobacillus och S. cerevisiae JBA

Figur 10 visar procentuell tillväxt i förh̊allnade till startkoncentration av Lactobacillus i
de olika ympkulturerna med JBA vildtypsjäst, JBA genmodifierad med L50A eller JBA
genmodifierad med β-defensin-3, vid olika tidpunkter. Bakterietillväxten har undersökts
efter odling p̊a MRS+cykloheximidplattor. En signifikant ökning av bakterietillväxt kan
här detekteras för JBA β-defensin-3, jämfört med vildtypsjästen, efter 6 timmar (Figur
10). Detta resultat g̊ar tvärt emot studien av James et al. (2013) p̊a β-defensin-3, när
den uttrycktes av Saccharomyces pastorianus stam CMBS-33, vilka s̊ag en signifikant
minskad bakteriekontamination av Lactobacillus brevis i odlingar p̊a pilotskala. I v̊ar
studie har andra jäststammar använts för att uttrycka de antimikrobiella peptiderna,
n̊agot som kan p̊averka resultatet, eftersom de olika jäststammarna kan vara olika bra
p̊a att uttrycka peptiden och utsöndra den ur cellen. Detta kan knappast förklara en
ökning av bakterietillväxten jämfört med vildtypen, d̊a problem med att utsöndra de
antimikrobiella peptiderna snarare skulle leda till att de genmodifierade jäststammarna
p̊averkade bakterierna p̊a samma sätt som vildtypsjästen.

Ökningen skulle istället kunna tillskrivas problemen vid de utförda spädningsserierna
av ympkulturerna, eftersom samma ökning av jästceller kan detekteras vid en jämförelse
med Figur 11. Skillnaden för bakterietillväxt i ympkulturen med JBA β-defensin-3 jäm-
fört med ympkulturen med vildtypsjäst (Figur 10) beror troligtvis p̊a att de spädningar
som gjordes vid utstyken efter 6 timmar antagligen var lägre än avsett, och därför gav
en mycket högre koncentration efter beräkningar fr̊an MRS+cykloheximid- och YPD-
plattorna (Tabell 8 och 9, Bilaga G), än den verkliga koncentrationen av bakterier och
jästceller i ympkulturen faktiskt var.

22


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 10 20 30

P
ro

ce
n

t 
av

 s
ta

rt
ko

n
ce

n
tr

at
io

n
 a

v
L
a
c
t
o
b
a
c
il
lu
s

Tid [h]

JBA wt

JBA L50A

JBA β-def.

Figur 10: Procentuell tillväxt i förh̊allande till startkoncentration av Lactobacillus brevis
och Lactobacillus buchneri över tid, d̊a de ympats ihop med vildtypen av JBA (bl̊a), JBA
genmodifierad med L50A (röd) eller JBA genmodifierad med β-defensin-3 (grön). Tillväx-
ten har beräknats fr̊an fyra olika MRS+cykloheximid-plattor, tv̊a med 105-spädning och tv̊a
med 106-spädning (Tabell 8, Bilaga G). Plattorna var behandlade med cykloheximid för att
inhibiera tillväxt av jästceller. Punkterna i grafen är medelvärdet av bakterietillväxten, be-
räknad fr̊an de fyra plattorna, för respektive jäststam. Felstaplarna visar medelfelet (Bilaga
F).

Figur 11 visar den procentuella tillväxten i förh̊allnade till startkoncentration av JBA
vildtypsjäst, JBA genmodifierad med L50A eller JBA genmodifierad med β-defensin-3
vid ympning med L. brevis och L. buchneri, vid olika tidpunkter. Figuren visar inga
signifikanta skillnader för jästtillväxten i de olika ympkulturerna med Lactobacillus, för-
utom för jäststammen genmodifierad med β-definsin-3, som har högre tillväxt en de
andra jäststammarna mellan 3 och 6 timmar. Denna skillnad tolkas som en effekt av
de spädningsfel som förekom vid utstryken p̊a de plattor som användes för att beräk-
na bakterie- och jästkoncentratonerna i ympkultureren för JBA β-definsin-3, vilka även
nämnts i tidigare stycken.

23


0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 10 20 30P
ro

ce
n

t 
av

 s
ta

rt
ko

n
ce

n
tr

at
io

n
e

n
 a

v
jä

st

Tid [h]

JBA wt

JBA L50A

JBA β-def.

Figur 11: Procentuell tillväxt i förh̊allnade till startkoncentration av vildtypen av JBA(bl̊a),
JBA genmodifierad med L50A (röd) eller JBA genmodifierad med β-defensin-3 (grön) d̊a de
ympats med L. brevis och L. buchneri. Tillväxten har beräknats fr̊an fyra olika YPD-plattor,
tv̊a med 105-spädning och tv̊a med 106-spädning (Tabell 8, Bilaga G). Punkterna i grafen
är medelvärdet av jästtillväxten, beräknad fr̊an de fyra plattorna för respektive jäststam.
Felstaplarna visar medelfelet (Bilaga F).

I Figur 12 har förh̊allandet mellan bakterietillväxt och jästtillväxt för JBA vildtyp-
sjäst, JBA genmodifierad med L50A och JBA genmodifierad med β-defensin-3 i de olika
ympkulturerna studerats, vid olika tidpunkter. Här kan de spädningsfel som p̊averkat
JBA β-defensin-3 i Figur 10 och Figur 11 undvikas, d̊a utstryken p̊a MRS+cykloheximid-
och YPD- plattorna gjordes fr̊an samma spädning av ympkulturen och därmed bör ge
samma koncentrationsfel. Förh̊allandet mellan dem är därför oberoende av om koncent-
rationerna var högre enligt plattorna än i den faktiska ympkulturen, eftersom ökningen
bör ha p̊averkat lika mycket för b̊ade bakteriernas och jästens tillväxtberäkningar. Denna
figur ger därmed en mer korrekt bild av hur de genmodifierade jäststammarna p̊averkat
bakterietillväxten än Figur 10 och Figur 11 var för sig.

I figuren kan en signifikant skillnad detekteras i förh̊allandet mellan bakterier och jäst
i ympkultureren för JBA L50A efter 3 timmar, med fler bakterier i denna ympkultur
jämfört med ympkulturen för JBA vildtypsjäst och JBA β-definsin-3 (Figur 12). Detta
tyder p̊a en motsatt effekt av den genmodifierade jäststammen p̊a bakterietillväxten än
den önskvärda. Denna effekt skulle återigen kunna vara en olycklig följd av det osäkra
beräkningsunderlaget som resultaten bygger p̊a, men även andra orsaker är naturligvis
möjliga. En s̊adan kan vara att JBA-stammen själv är känslig för den antimikrobiella
peptiden L50A. Ingen garanti finns för att de, av den genmodifierade jästen eventuellt
uttryckta antimikrobiella peptiderna, endast p̊averkar bakterier. Risken finns att de även
skulle kunna ha effekt p̊a membranen hos jästen. Mekanismen hos dessa antimikrobiella
peptider har inte undersökts i denna studie. Inget försök gjordes heller där endast jäst-

24


tillväxten för vildtypsjäst jämfördes med tillväxten för den genmodifierade jästen – utan
inblandning av bakterier. Därför kan inte uteslutas att, om den genmodifierade jästen
lyckats uttrycka och utsöndra antimikrobiella peptider, dessa inte hade en negativ effekt
p̊a jästen själv.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30

R
at

io
 m

e
lla

n
L
a
c
t
o
b
a
c
il
lu
s

o
ch

 J
B

A

Tid [h]

JBA wt

JBA L50A

JBA β-def.

Figur 12: Förh̊allande mellan Lactobacillus-stammarna och vildtypen av JBA (bl̊a), JBA
genmodifierad med L50A (röd) och JBA genmodifierad med β-defensin-3 (grön) för respek-
tive ympkultur. Tillväxten har beräknats fr̊an fyra olika MRS+cykloheximid-plattor, tv̊a
med 105-spädning och tv̊a med 106-spädning, samt fyra YPD-plattor med samma spädning-
ar (Tabell 8, Bilaga G). Resultatet fr̊an MRS+cykloheximid-plattorna har dividerats med
YPD-plattorna för att eliminera spädningsfel. MRS+cykloheximid-plattorna var behandlade
med cykloheximid för att inhibiera tillväxt av jästceller. Punkterna i grafen är medelvär-
det av förh̊allandet mellan varje MRS+cykloheximid- och YPD-platta vid given tidpunkt.
Felstaplarna visar medelfelet (Bilaga F).

5 Slutsats

En lyckad genmodifiering av Saccharomyces cervisiae JBA och Saccharomyces cervisiae
CEN.PK genomfördes med hjälp av homolog rekombination, för att integrera gener för
de antimikrobiella peptiderna L50A eller β-defensin-3 i de tv̊a jäststammarnas genom.

N̊agon undersökning av translationen av de antimikrobiella peptiderna fr̊an de tv̊a
genmodifierade jäststammarna gjordes inte. Därför kan ingen slutsats dras om huruvida
jäststammarna faktiskt translaterade de antimikrobiella peptiderna. Detta kunde ha un-
dersökts med exempelvis HPLC, eller western blotting med korrekta antikroppar, som
dock kan vara sv̊art att f̊a tag p̊a kommersiellt i det här fallet. Det faktum att translation
av de antimikrobiella peptiderna inte har fastställts för n̊agon av de genmodifierade jäst-
stammarna gör att resultaten av de ympningsförsök som gjordes med de genmodifierade
jäststammarna och Lactobacillus bör betraktas med försiktighet.

25


Den avdödande effekten p̊a Lactobacillus brevis och Lactobacillus buchneri av de an-
timikrobiella peptiderna L50A och β-definsin-3 kunde inte med säkerhet fastställas. Efter
ympningsförsök med de olika genmodifierade jäststammarna tillsammans med L. brevis
och L. buchneri kunde en liten avdödningseffekt detekteras för S. cervisiae CEN.PK
genmodifierad med L50A efter 6 timmar. Effekten avtog dock över tid, till att sluta
p̊a samma niv̊a av bakteriekontamination för CEN.PK L50A som för CEN.PK vildtyp-
sjäst. Motsatt effekt p̊a bakteriekontamination av Lactobacillus detekterades för den med
L50A genmodifierade jäststammen S. cervisiae JBA, som visade sig vara sämre än JBA
vildtypsjäst p̊a att bekämpa bakteriekontamination. Detta skulle kunna bero p̊a en käns-
lighet hos JBA-stammen mot denna antimikrobiella peptid. Den initiala positiva effekten
p̊a bakteriekontaminationen hos CEN.PK L50A och den negativa effekten hos JBA L50A
skulle kunna tillskrivas andra faktorer än den antimikrobiella peptiden L50A. Detta p̊a
grund av mycket f̊a och osäkra mätvärden som l̊ag till grund för de beräkningar som gjor-
des efter ympförsök med Lactobacillus och de genmodifierade jäststammarna. Dessutom
försäkrades inte att de genmodifierade jäststammarna överhuvudtaget uttryckte n̊agra
antimikrobiella peptider, n̊agot som kunde ha gjorts genom att undersöka supernatanten
i de olika ympkulturerna efter antimikrobiella peptider.

Ytterligare försök hade behövt genomföras p̊a fler ympkulturer mellan de genmo-
difierade jäststammarna S. cervisiae CEN.PK och S. cervisiae JBA med Lactobacillus,
där även utsöndringen av antimikrobiella peptider i ympkulturen studerades, för att
med säkerhet kunna fastställa n̊agon eventuell avdödande effekt av de antimikrobiella
peptiderna β-defensin-3 och L50A.

5.1 Förslag p̊a vidare studier

Som efterföljande studie hade effekten av L50A och β-defensin-3 p̊a andra typer av kon-
taminerande bakterier kunnat studeras. Acetobacter konsumerar en stor del av näringen
i mediet under industriella fermentationsprocesser (Albers et al., 2011), vilket gör dem
intressanta att undersöka.

En annan uppföljning skulle kunna vara att undersöka hur jäststammarna själva
p̊averkas av att ha blivit genmodifierade med L50A respektive β-defensin-3. En studie
som analyserar hur de modifierade stammarna växer i förh̊allande till vildtypsjäst vore
passande som utg̊angspunkt.

Olika odlingsmedier har visat sig ge olika resultat för den antimikrobiella peptiden
L50A p̊a bakterier (Basanta et al., 2009). En liknande studie för β-defensin-3 vore därför
relevant att genomföra.

26


Referenser

Albers, E., Johansson, E., Franzén, C.-J., och Larsson, C. (2011). Selective suppression of bacterial
contaminants by process conditions during lignocellulose based yeast fermentations. Biotechnology for
Biofuels, 4(59).

Albers, E. och Larsson, C. (2009). A comparison of stress tolerance in YPD and industrial lignocellulose-
based medium among industrial and laboratory yeast strains. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 36:1085–1091.

Alexander, M. (1971). Microbial ecology. John Wiley and Sons, London.

Basanta, A., Herranz, C., Gutiérrez, J., och Criado, R. (2009). Development of Bacteriocinogenic Strains
of Saccharomyces cerevisiae Heterologously Expressing and Secreting the Leaderless Enterocin L50
Peptides L50A and L50B from Enterococcus faecium L50∇. Applied and Environmental Microbiology,
75(8):2382–2392.

Basanta, A., Sánchez, J., Gómez-Sala, B., Herranz, C., Hernández, P., och Cintas, L. (2008). Antimicro-
bial activity of Enterococcus faecium L50, a strain producing enterocins L50 (L50A and L50B), P and
Q, against beer-spoilage lactic acid bacteria in broth, wort (hopped and unhopped), and alcoholic and
non-alcoholic lager beers. International Journal of Food Microbiology, 125(3):293–307.

Beckner, M., Ivey, M., och Phister, T. (2011). Microbial contamination of fuel ethanol fermentations.
Letters in Applied Microbiology, 53(4):387–394.

Bennetzen, J. och Hall, B. (1982). The Primary Structure of the Saccharomyces cerevisiae Gene for
Alcohol Dehydrogenase 1. The Journal of Biological Chemistry, 257(6):3018–3025.

Bergey, D., Harrison, F., Breed, R., Hammer, B., och Huntoon, F. (1923). Bergey’s Manual of Determi-
native Bacteriology. The William and Wilkins Company, Baltimore.

Bischoff, K., Skinner-Nemec, K., och Leathers, T. (2007). Antimicrobial susceptibility of Lactobacillus
species isolated from commercial ethanol plants. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,
34(11):739–744.

Bitter, G., Chen, K., Banks, A., och Lai, P.-H. (1984). Secretion of foreign proteins from Saccharomy-
ces cerevisiae directed by α-factor gene fusions. Proceedings of the National Academy of Sciences,
81(17):5330–5334.

Boman, H. (2003). Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts. Journal of Internal
Medicine, 254(3):197–215.

Canelas, A., Harrison, N., Fazio, A., Zhang, J., Pitkänen, J.-P., van den Brink, J., Bakker, B., Bogner,
L., Bouwman, J., Castrillo, J., Cankorur, A., Chumnanpuen, P., Daran-Lapujade, P., Dikicioglu, D.,
van Eunen, K., Ewald, J., Heijnen, J., Kirdar, B., Mattila, I., Mensonides, F., Niebel, A., Penttilä,
M., Pronk, J., Reuss, M., Salusjärvi, L., Sauer, U., Sherman, D., Siemann-Herzberg, M., Westerhoff,
H., de Winde, J., Petranovic, D., Oliver, S., Workman, C., Zamboni, N., och J, N. (2010). Integrated
multilaboratory systems biology reveals differences in protein metabolism between two reference yeast
strains. Nature Communication, 1(145).

Caplan, S., Green, R., Rocco, J., och Kurjan, J. (1990). Glycosylation and structure of the yeast MF
α 1 α-factor precursor is important for efficient transport through the secretory pathway. Journal of
Bacteriology, 173(2):627–635.

Chan, D., Prenner, E., och Vogel, H. (2006). Tryptophan- and arginine-rich antimicrobial peptides:
structures and mechanisms of action. Biochimica et Biophysica Acta, 1758(9):1184–1202.

27


Chang, I., Byung-Hong, K., Pyong-Kyun, S., och Wan-Kyu, L. (1995). Bacterial Contamination and Its
Effects on Ethanol Fermentation. Microbiology Biotechnology, 5(6):309–314.

Cintas, L., Casaus, P., Holo, H., Hernandez, P., Nes, I., och H̊avarstein, L. (1998). Enterocins L50A
and L50B, Two Novel Bacteriocins from Enterococcus faecium L50, Are Related to Staphylococcal
Hemolysins. Journal of Bacteriology, 180(8):1988–1994.

Compart, D., Carlson, A., Crawford, G., Fink, R., Diez-Gonzalez, F., Dicostanzo, A., och Shurson,
G. (2013). Presence and biological activity of antibiotics used in fuel ethanol and corn co-product
production. Journal of Animal Science, 91(5):2395–2404.

Corsetti, A., Gobbetti, M., Rossi, J., och Damiani, P. (1998). Antimould activity of sourdough lactic
acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1.
Applied Microbiological Biotechnology, 50(2):253–256.

Criado, R., Gutiérrez, J., Mart́ın, M., Herranz, C., Hernández, P., och Cintas, L. (2006). Immunochemical
Characterization of Temperature-Regulated Production of Enterocin L50 (EntL50A and EntL50B),
Enterocin P, and Enterocin Q by Enterococcus faecium L50∇. Applied and Environmental Microbio-
logy, 72(12):7634–7643.

Das, R., Shultz, J., och Lehman, D. (1989). α-factor leader sequence-directed transport of Escherichia
coli beta-galactosidase in the secretory pathway of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General
Genetics, 218(2):240–248.

Diep, D. B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., och Nes, I. F. (2007). Common mechanisms of target cell
recognition and immunity for class ii bacteriocins. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 104(7):2384–2389.

Dobi, K. C. och Winston, F. (2007). Analysis of Transcriptional Activation at a Distance in Saccha-
romyces cerevisiae∇. Molecular and Cellular Biology, 27(15):5575–5586.

Du Toit, M., Dicks, L. M., och Holzapfel, W. (2001). Taxonomy of obligately homofermentative and
facultatively heterofermentative lactobacilli in pig faeces. Letters in Applied Microbiology, 32(3):199–
204.

Esnault, Y., Blondel, M.-O., Deshaies, R., Scheckman, R., och Képès, F. (1993). The yeast SSS1 gene is
essential for secretory protein translocation and encodes a conserved protein of endoplasmic reticulum.
The EMBO journal, 12(11):4083–4093.

Filya, I., Sucu, E., och Karabulut, A. (2006). The effect of Lactobacillus buchneri on the fermenta-
tion, aerobic stability and ruminal degradability of maize silage. Journal of Applied Microbiology,
101(6):1216–1223.

Flessel, M., Brake, A., och Thorner, J. (1989). The mfαl gene of saccharomyces cerevisiae: Genetic
mapping and mutational analysis of promoter elements. Genetics, 121(2):223–236.

Ghazal, G., Gagnon, J., Jacques, P.-E., Landry, J.-R., Robert, F., och Elela, S. (2009). Yeast rnase iii
triggers polyadenylation-independent transcription termination. Molecular Cell, 36(1):99–109.

Gibson, B., Lawrence, S., Powell, C., och Smart, K. (2007). Yeast responses to stresses associated with
industrial brewery handling. FEMS Microbiology Reviews, 31(5):535–569.

Guilhelmelli, F., Vilela, N., Albuquerque, P., Derengowski, L., Silva-Pereira, I., och Kyaw, C. (2013).
Antibiotic development challenges: the various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of
bacterial resistance. Frontiers in Microbiology, 4(352).

28


Gunn, J. (2008). The salmonella pmrab regulon: lipopolysaccharide modiciations, antimicrobial peptide
resistance and more. Trends in Microbiology, 16(6):284–290.

Hancock, R. (1997). Peptide antibiotics. The Lancet, 349(9049):418–422.

Hancock, R. och Sahl, H.-G. (2006). Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective
therapeutic strategies. Nature Biotechnology, 24(12):1551–1557.

Hassan, M., Kjos, M., Nes, I., Diep, D., och Lotfipour, F. (2012). Natural antimicrobial peptides from
bacteria: characteristics and potential applications to fight against antibiotic resistance. Journal of
Applied Microbiology, 113(4):723–736.

Holland, J., Labieniec, L., Swimmer, C., och Holland, M. (1983). Homologous Nucleotide Sequences at the
5’ Termini of Messenger RNAs Synthesized from the Yeast Enolase and Glyceraldehyde-3-phosphate
Dehydrogenase Gene Families. The Journal of Biological Chemistry, 258(8):5291–5299.

Hoover, D., Wu, Z., Tucker, K., Lu, W., och Lubkowski, J. (2003). Antimicrobial characterization of
human βl-defensin 3 derivatives. Antimicrobal Agents and Chemotherapy, 47(9):2804–2809.

James, T., Gallagher, L., Titze, J., Bourke, P., Kavanagh, J., Arendt, E., och Bond, U. (2013). In
situ production of human β defensin-3 in lager yeasts provided bactericidal activity against beer-
spoiling bacteria under fermentation conditions. Journal of Applied Microbiology (epub ahead of
print), 116(2):368–379.

Jespersen, L. och Jakobsen, M. (1996). Specific spoilage organisms in breweries and laboratory media
for their detection. International Journal of Food Microbiology, 33(1):139–155.

Jin, L., Yuan, D., Wang, Y., Jiang, C., Wang, Z., Zhao, Q., och Wang, Q. (2013). Expression of An-
timicrobial Peptide Dybowskin-2CAMa in Pichia pastoris and Characterization of its Antibacterial
Activity. Advance Journal of Food Science and Technology, 5(8):1005–1010.

Julius, D., Brake, A., Blair, L., Kunisawa, R., och Thorner, J. (1984a). Isolation of the putative structural
gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for processing of yeast prepro-α-factor.
Cell, 37(3):1075–1089.

Julius, D., Schekman, R., och Thorner, J. (1984b). Glycosylation and processing of prepro-alpha-factor
through the yeast secretory pathway. Cell, 36(2):309–318.

Kandler, O. (1982). Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek,
49(3):209–224.

Klotman, M. och Chang, T. (2006). Defensins in innate antiviral immunity. Nature Reviews Immunology,
6(6):447–456.

Kniskern, P., Hagopian, A., Montgomery, D., Burke, P., Dunn, N., Hofmann, K., Miller, W., och El-
lis, R. (1986). Unusually high-level expression of a foreign gene (hepatitis B virus core antigen) in
Saccharomyces cerevisiae. Gene, 46(1):135–141.

Kraus, D. och Peschel, A. (2008). Staphylococcus aureus evasion of innate antimicrobial defense. Future
Microbiology, 3(4):437–451.

Kurjan, J. och Herskowitz, I. (1982). Structure of a yeast pheromone gene (mfα): A putative α-factor
precursor contains four tandem copies of mature α-factor. Cell, 30(3):933–943.

Kuroda, S., Otaka, S., och Fujisawa, Y. (1994). Fermentable and Nonfermentable Carbon sources Sustain
Constitutive Levels of Expression of Yeast Trisosephosphate Dehydrogenase 3 Gene from Distinct
Promoter Elements. The Journal of Biological Chemistry, 269(8):6153–6162.

29


Kuroda, S., Otaka, S., Miyazaki, T., Nakao, M., och Fujisawa, Y. (1992). Hepatitis B Virus Envelope L
Protein Particles. The Journal of Biological Chemistry, 267(3):1953–1961.

Levy, S. (2002). Factors impacting on the problem of antibiotic resistance. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 49(1):25–30.

Lin, Y., Zhang, Wand Li, C., Sakakibara, K., Tanaka, S., och Kong, H. (2012). Factors affecting ethanol
fermentation using saccharomyces cerevisiae by4742. Biomass and Bioenergy, 47:395–401.

Liu, S., Skinner-Nemec, K., och Leathers, T. (2007). Lactobacillus buchneri strain NRRL B-30929
converts a concentrated mixture of xylose and glucose into ethanol and other products. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology, 35(2):75–81.

McAlister, L. och Holland, M. (1985). Differential Expression of the Three Yeast Glyceraldehyde-3-
phopshate Dehydrogenase Genes. The Journal of Biological Chemistry, 260(28):15019–1527.

Nes, I., Diep, D., H̊avarstein, L., Brurberg, M., Eijsink, V., och Holo, H. (1996). Biosynthesis of bacte-
riocins in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 70(2-4):113–128.

Nijkamp, J., van den Broek, M., Datema, E., de Kok, S., Bosman, L., Luttik, M., Daran-Lapujade, P.,
Vongsangnak, W., Nielsen, J., Heijne, W., Klaassen, P., Paddon, C., Platt, D., Kötter, P., van Ham,
R., Reinders, M., Pronk, J., de Ridder, D., och Daran, J.-M. (2012). De novo sequencing, assembly
and analysis of the genome of the laboratory strain Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D, a model
for modern industrial biotechnology. Microbial Cell Factories, 11(63).

Nissen-Meyer, J. och Nes, I. (1997). Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: their function,
structure, biogenesis, and mechanism of action. Archives of Microbiology, 167(2/3):67–77.

Papagianni, M. (2003). Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis,
structure, function and applications. Biotechnology Advances, 21(6):465–499.

Polyak, S., Forsberg, G., Forbes, B., McNiel, K., Aplin, S., och Wallace, J. (1997). Introduction of
spacer peptides n-terminal to a cleavage recognition motif in recombinant fusion proteins can improve
site-specific cleavage. Protein Engineering, 10(6):615–619.

Sharpe, M. (1979). Identification Methods for Microbiologists. Academic Press, London.

Skinner, K. och Leathers, T. (2004). Bacterial contaminants of fuel ethanol production. Journal of
Industrial Microbiological Biotechnology, 31(9):401–408.

Suzuki, K., Iijima, K., Sakamoto, K., Sami, M., och Yamashita, H. (2006). A review of hop resistance
in beer spoilage lactic acid bacteria. Journal of the Institute of Brewing, 112(2):173–191.

Weber, D., Sam, K., Polen, T., Wendisch, V., och Antranikian, G. (2008). Oligonucleotide microarrays
for the detection and identification of viable beer spoilage bacteria. Journal of Applied Microbiology,
105(4):951–962.

White, S., Wimley, W., och M., S. (1995). Structure, function and membrane integration of defensins.
Current Opinion in Structural Biology, 5(4):521–527.

Yang, D., Chertov, O., Bykovskaia, S., Chen, Q., Buffo, M., Shogan, J., Anderson, M., Schröder, J.,
Wang, J., Howard, O., och Oppenheim, J. (1999). β-defensins: linking innate and adaptive immunity
through dendritic and t cell ccr6. Science, 286(5439):525–528.

Yoshimura, K., Toibana, A., Kikuchi, K., Kobayashi, M., Hayakawa, T., Nakahama, K., Kikuchi, M., och
Ikehara, M. (1987). Differences between Saccharomyces cerevisiae and Bacillus subtilis in secretion of
human lysozyme. Biochemical and Biophysical Research Communications, 145(2):712–718.

30


Bilagor

A Ledarsekvens

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPF
SNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKREAEA

Efter de tv̊a positioner som kan ses som understrukna aminosyror klipper endopeptidaset
KEX2. De fyra sista aminosyrorna (bl̊a text) klyvs bort av aminopeptidaset STE13.

31


B Beställda gensekvenser

Gult: α-ledarsekvens
Grönt: Antimikrobiell peptid

Kodonoptimerad sekvens för antimikrobiell peptid L50A med α-ledare för
ligering i pUC57-TDH3-EFE-vektor, klippt med BamHI/AscI

ggatccATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTTCGCTGCTTCTTCT
GCTTTGGCTGCTCCAGTTAATACTACTACTGAAGATGAAACTGCTCAAATT
CCAGCTGAAGCTGTTATTGGTTATTTGGATTTGGAAGGTGATTTCGATGTT
GCTGTTTTGCCATTCTCTAATTCTACTAATAATGGTTTGTTGTTCATTAAT
ACTACTATTGCTTCTATTGCTGCTAAAGAAGAAGGTGTTTCTTTGGATAAA
AGAGAAGCTGAAGCTATGGGTGCTATTGCTAAATTGGTTGCTAAATTCGGT
TGGCCAATTGTTAAAAAATATTATAAACAAATTATGCAATTCATTGGTGAA
GGTTGGGCTATTAATAAAATTATTGAATGGATTAAAAAACATATTTAAggcgc
gcc

Kodonoptimerad sekvens för antimikrobiell peptid β-defensin-3 med α-ledare
för ligering i pUC57-TDH3-EFE-vektor, klippt med BamHI/AscI

ggatccATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTTCGCTGCTTCTTCT
GCTTTGGCTGCTCCAGTTAATACTACTACTGAAGATGAAACTGCTCAAATT
CCAGCTGAAGCTGTTATTGGTTATTTGGATTTGGAAGGTGATTTCGATGTT
GCTGTTTTGCCATTCTCTAATTCTACTAATAATGGTTTGTTGTTCATTAAT
ACTACTATTGCTTCTATTGCTGCTAAAGAAGAAGGTGTTTCTTTGGATAAA
AGAGAAGCTGAAGCTGGTATTATTAATACTTTGCAAAAATATTATTGTAGA
GTTAGAGGTGGTAGATGTGCTGTTTTGTCTTGTTTGCCAAAAGAAGAACAA
ATTGGTAAATGTTCTACTAGAGGTAGAAAATGTTGTAGAAGAAAAAAATAA
ggcgcgcc

32


C Målplasmider (amplifierade E. coli-plasmider)

Nedan följer sekvenserna till de m̊alplasmider som transformerades in i E. coli för att
sedan amplifieras och renas ut.

C.1 L50A

Orange: Homologiregion för jäst (DAK2 up och DAK2 dw primersites understrukna)
Lila: TDH3-promotor (TDH3p rev primersite understruken)
Gult: α-ledarsekvens
Grönt: Antimikrobiell peptid (L50A)
Brunt: ADH1-terminator
Röd region: Kanamycinresistensgen (KanMX fw primersite understruken).
Kanamycinresistensgenen är omringad av en TEF1-promotor och TEF-terminator
fr̊an Schizosaccharomyces pombe (ej utmarkerat).
Bl̊att: Ampicillinresistensgen

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG
AGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGT
CAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGC
GGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACC
GCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAG
GCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACG
CcagctgTTCATGCATCTAAGAAATCAACCTATATCAACAGATTTCAATAATTA
CTCTAAACTTATGCTGTAACTTAGAAAGTAACCAGCCTGTGTTGACTGATT
GAGTTGCGTATTAACTGCGCCTAGTCATTTCAACACTTATAATTTGCTTCA
GCTTAAGTGTGGTTCATCTTTTTTTTTCTGGAAACTTTGCATGCCCTCAAA
gtcgacCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAA
TATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTA
AATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATC
CCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATT
CTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGC
ACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGG
CAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTT
CTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCC
CTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATT
GATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTAT
AGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAA
CACACATAAACAAACAAAggatccATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTT
TTGTTCGCTGCTTCTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTTAATACTACTACTGAA
GATGAAACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCTGTTATTGGTTATTTGGATTTG
GAAGGTGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTCTCTAATTCTACTAATAAT
GGTTTGTTGTTCATTAATACTACTATTGCTTCTATTGCTGCTAAAGAAGAA
GGTGTTTCTTTGGATAAAAGAGAAGCTGAAGCTATGGGTGCTATTGCTAA

33


ATTGGTTGCTAAATTCGGTTGGCCAATTGTTAAAAAATATTATAAACAAAT
TATGCAATTCATTGGTGAAGGTTGGGCTATTAATAAAATTATTGAATGGAT
TAAAAAACATATTTAAggcgcgccACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTT
ATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTT
TAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCT
TTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGTATGAGGTCGCTCTTATT
GACCACACCTCTACCGGCAGATCCGCTAGGGATAACAGGGTAATATgagctca
taacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgcggccgctaggtctagagatctgtttagcttgcctcgtccccgccggg
tcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgactg
tcgcccgtacatttagcccatacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaa
aattacggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgccc
ctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttgctaggatacag
ttctcacatcacatccgaacataaacaaccatgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaacat
ggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaa
gcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaa
actggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcg
atccccggcaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttc
ctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacg
aatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaat
gcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagggga
aattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcg
gtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcattt
gatgctcgatgagtttttctaatcagtactgacaataaaaagattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttata
ttgtagttgttctattttaatcaaatgttagcgtgatttatattttttttcgcctcgacatcatctgcccagatgcgaagttaagt
gcgcagaaagtaatatcatgcgtcaatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatactaacgccgccatcc
agtgtcgaaaacgagctttcgagaacccttaatgcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatGCATG
AGTAGTTAGTTATCTTTTTGACAATGATCTCTTTTGAAAATATCTACTGTA
GATTTGCATGGACGCACGTCGCCCATACGCCAAACTTTGGCAATGATACTC
GTTATTCGTAATATCAGTCCGTCAAGGTGCTGTGATTTCTCTATTTTATAT
TGCCTATTATTTTTTCAAATGATTTGAGCCGTTTTAAATTGAcagctgCATTAA
TGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC
CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGC
GGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGA
TAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACC
GTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACG
AGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGAC
TATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTG
TTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAA
GCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGG
TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACC
GCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACG
ACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGT
ATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA

34


CTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCG
GAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCG
GTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTC
AAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA
ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCT
AGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATG
AGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT
CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGT
AGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGA
TACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC
CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCA
TCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTA
ATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCT
CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAG
TTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTC
CGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGG
CAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTG
TGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGAC
CGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCA
GAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCT
CAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCAC
CCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAA
AAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAA
TGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAG
GGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAA
CAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAA
GAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGG
CCCTTTCGTC

35


C.2 β-defensin-3

Orange: Homologiregion för jäst (DAK2 up och DAK2 dw primersites understrukna)
Lila: TDH3-promotor (TDH3p rev primersite understruken)
Gult: α-ledarsekvens
Grön: Antimikrobiell peptid (β-defensin-3)
Brun: ADH1-terminator
Röd region: Kanamycinresistensgen (KanMX fw primersite understruken).
Kanamycinresistensgenen är omringad av en TEF1-promotor och TEF-terminator
fr̊an Schizosaccharomyces pombe (ej utmarkerat).
Bl̊att: Ampicillinresistensgen

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG
AGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGT
CAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGC
GGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACC
GCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAG
GCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACG
CcagctgTTCATGCATCTAAGAAATCAACCTATATCAACAGATTTCAATAATTA
CTCTAAACTTATGCTGTAACTTAGAAAGTAACCAGCCTGTGTTGACTGATT
GAGTTGCGTATTAACTGCGCCTAGTCATTTCAACACTTATAATTTGCTTCA
GCTTAAGTGTGGTTCATCTTTTTTTTTCTGGAAACTTTGCATGCCCTCAAA
gtcgacCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAA
TATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTA
AATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATC
CCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATT
CTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGC
ACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGG
CAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTT
CTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCC
CTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATT
GATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATA
GTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAAC
ACACATAAACAAACAAAggatccATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTT
TGTTCGCTGCTTCTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTTAATACTACTACTGAAG
ATGAAACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCTGTTATTGGTTATTTGGATTTGG
AAGGTGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTCTCTAATTCTACTAATAATG
GTTTGTTGTTCATTAATACTACTATTGCTTCTATTGCTGCTAAAGAAGAAG
GTGTTTCTTTGGATAAAAGAGAAGCTGAAGCTGGTATTATTAATACTTTGC
AAAAATATTATTGTAGAGTTAGAGGTGGTAGATGTGCTGTTTTGTCTTGTT
TGCCAAAAGAAGAACAAATTGGTAAATGTTCTACTAGAGGTAGAAAATGTT
GTAGAAGAAAAAAATAAggcgcgccACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATT
TATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATT
TTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTC

36


TTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGTATGAGGTCGCTCTTAT
TGACCACACCTCTACCGGCAGATCCGCTAGGGATAACAGGGTAATATgagctc
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgcggccgctaggtctagagatctgtttagcttgcctcgtccccgccgg
gtcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgact
gtcgcccgtacatttagcccatacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaa
aaattacggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcc
cctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttgctaggataca
gttctcacatcacatccgaacataaacaaccatgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaaca
tggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatggga
agcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaa
actggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcg
atccccggcaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttc
ctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacg
aatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaat
gcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagggga
aattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcg
gtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcattt
gatgctcgatgagtttttctaatcagtactgacaataaaaagattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttata
ttgtagttgttctattttaatcaaatgttagcgtgatttatattttttttcgcctcgacatcatctgcccagatgcgaagttaagt
gcgcagaaagtaatatcatgcgtcaatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatactaacgccgccatcc
agtgtcgaaaacgagctttcgagaacccttaatgcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatGCATG
AGTAGTTAGTTATCTTTTTGACAATGATCTCTTTTGAAAATATCTACTGTA
GATTTGCATGGACGCACGTCGCCCATACGCCAAACTTTGGCAATGATACTC
GTTATTCGTAATATCAGTCCGTCAAGGTGCTGTGATTTCTCTATTTTATAT
TGCCTATTATTTTTTCAAATGATTTGAGCCGTTTTAAATTGAcagctgCATTAA
TGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC
CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGC
GGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGA
TAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACC
GTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACG
AGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGAC
TATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTG
TTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAA
GCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGG
TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACC
GCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACG
ACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGT
ATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA
CTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCG
GAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCG
GTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTC
AAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA
ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCT

37


AGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATG
AGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT
CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGT
AGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGA
TACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC
CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCA
TCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTA
ATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCT
CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAG
TTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTC
CGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGG
CAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTG
TGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGAC
CGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCA
GAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCT
CAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCAC
CCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAA
AAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAA
TGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAG
GGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAA
CAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAA
GAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGG
CCCTTTCGTC

38


D Linjärt insert för inkorporering i jästgenomet

Nedan följer de linjära insert, erh̊allen genom PCR av plasmiderna fr̊an Bilaga C med
primrarna DAK2 up och DAK2 dw, som transformerades in i jästgenomet via homolog
rekombination. Samma färgkodning som för Bilaga C används.

D.1 L50A-insert

CATGCATCTAAGAAATCAACCTATATCAACAGATTTCAATAATTACTCTAA
ACTTATGCTGTAACTTAGAAAGTAACCAGCCTGTGTTGACTGATTGAGTT
GCGTATTAACTGCGCCTAGTCATTTCAACACTTATAATTTGCTTCAGCTTA
AGTGTGGTTCATCTTTTTTTTTCTGGAAACTTTGCATGCCCTCAAAgtcgacC
TGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATA
TAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATA
TAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAG
CACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTT
AGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAAC
CTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATT
GACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCT
CTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAA
ATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTG
TAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAG
TCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACA
TAAACAAACAAAggatccATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTTC
GCTGCTTCTTCTGCTTTGGCTGCTCCAGTTAATACTACTACTGAAGATGAA
ACTGCTCAAATTCCAGCTGAAGCTGTTATTGGTTATTTGGATTTGGAAGGT
GATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTCTCTAATTCTACTAATAATGGTTTG
TTGTTCATTAATACTACTATTGCTTCTATTGCTGCTAAAGAAGAAGGTGTT
TCTTTGGATAAAAGAGAAGCTGAAGCTATGGGTGCTATTGCTAAATTGGTT
GCTAAATTCGGTTGGCCAATTGTTAAAAAATATTATAAACAAATTATGCAA
TTCATTGGTGAAGGTTGGGCTATTAATAAAATTATTGAATGGATTAAAAAA
CATATTTAAggcgcgccACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTT
TTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTG
ACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGT
AGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGTATGAGGTCGCTCTTATTGACCACA
CCTCTACCGGCAGATCCGCTAGGGATAACAGGGTAATATgagctcataacttcgtataa
tgtatgctatacgaagttatgcggccgctaggtctagagatctgtttagcttgcctcgtccccgccgggtcacccggccagcg
acatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacattta
gcccatacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaattacggctcctcgc
tgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataa
aaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttgctaggatacagttctcacatcacatccga
acataaacaaccatgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatggg
tataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttg
tttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgc

39


ctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggcaaaacagcattc
caggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcc
tgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgc
gagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccg
gattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttgga
cgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacg
gctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagt
actgacaataaaaagattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttatattgtagttgttctattttaatcaaatg
ttagcgtgatttatattttttttcgcctcgacatcatctgcccagatgcgaagttaagtgcgcagaaagtaatatcatgcgtc
aatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatactaacgccgccatccagtgtcgaaaacgagctttcgaga
acccttaatgcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatGCATGAGTAGTTAGTTATCT
TTTTGACAATGATCTCTTTTGAAAATATCTACTGTAGATTTGCATGGACGC
ACGTCGCCCATACGCCAAACTTTGGCAATGATACTCGTTATTCGTAATATC
AGTCCGTCAAGGTGCTGTGATTTCTCTATTTTATATTGCCTATTATTTTTT
CAAATGATTTGAGCCGTTTTAAATTG

D.2 β-defensin-3-insert

CATGCATCTAAGAAATCAACCTATATCAACAGATTTCAATAATTACTCTAA
ACTTATGCTGTAACTTAGAAAGTAACCAGCCTGTGTTGACTGATTGAGTT
GCGTATTAAC