Utveckling av biosensorer för

Abstract

Användning av s.k. cellfabriker är en växande metod för produktion av olika kemikalier. Exempelvis gör den begränsade möjligheten till ökad odling av kakaobönor det intressant att hitta alternativa metoder för framställning av kakaosmör. Produktion av kakaosmör-liknande lipider med hjälp av jäst hade här kunnat vara ett alternativ. Kakaosmör består huvudsakligen av triacylglyceroler, som innehåller främst mättade fett-syror. För att underlätta arbetet med att ta fram jäststammar som producerar rätt typ av fettsyror, krävs ett sätt att snabbt identifiera celler av intresse. En biosensor som ger ett visuellt utslag vid närvaro av mättade fettsyror, skulle på så sätt vara till stor nytta vid utvärdering av cellbibliotek. I detta arbetet har två potentiella system för detta testats i Saccharomyces cerevisiae med grönt fluorescerande protein, GFP, för visuellt utslag. System 1 i detta projekt grundar sig i repressorn DesT från Pseudomonas aeruginosa. Den-na repressor inhiberar transkription genom att binda till DNA, men släpper från DNA och möjliggör transkription, om mättade fettsyror finns i överskott. För att föra in detta sy-stem som en biosensor i S. cerevisiae, användes en vektor med GFP under en promotor innehållande bindningssäten för DesT, samt genen desT. System 2 baseras på proteinet Mga2, som finns naturligt i jäst. Detta protein har förmågan att detektera mättade fettsy-ror, varpå en mindre del av proteinet klyvs av och transporteras in i kärnan. Detta system utnyttjades vid utvecklingen av biosensorn genom användning av split GFP. GFP11 sat-tes ihop med MGA2 i en plasmid. Ytterligare en vektor användes för att introducera GFP1-10, tillsammans med en lokaliseringssekvens, i S. cerevisiae. Med båda dessa kom-ponenter närvarande i cellen möjliggörs förening av de två delarna i kärnan och därmed ett fluorescensutslag vid detektion av mättade fettsyror. Båda system var framgångsrikt konstruerade och transformerade i S. cerevisiae. För att undersöka huruvida de båda systemen kunde ge ett fluorescensutslag användes flödescytometri. I ett test utan fettsyror visade båda systemen att de fungerade i avseendet att de kunde ge ett fluorescensutslag. Test med olika koncentrationer av mättade och omättade fettsyror i mediet utfördes sedan för att undersöka systemens respons på olika mängder mättade fettsyror. Varken system 1 eller system 2 gav någon noterbar skillnad i respons vid olika mängder mättade fettsyror i tillväxtmediet. För system 2 testades även olika tillväxttemperaturer för att inducera en skillnad i membranets fettsyrakomposition, men inte heller detta gav någon skillnad i biosensorns utslag. Eftersom båda systemen uppvisar fluorescens, kan det finnas potential att utveckla dessa och använda dem som biosensorer. Mer studier krävs dock för att avgöra om det är möjligt att få systemen att ge olika stark fluorescens beroende på cellens fettsyrakomposition.